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A la croisée de la biologie, de la biochimie, de l’électronique, de la mécanique des fluidiques et de la thermodynamique, de nouveaux outils se préparent. Ceux-ci viendront peut être trouver des applications dans les laboratoires de génomique mais au-delà de cette perspective, ils pourraient trouver des applications au niveau des professionnels de santé eux-mêmes avant d’être accessibles aux clients-patients-citoyens directement.

Les Lab-on-Chips (ou Laboratoire sur puce) sont un concept qui a émergé dans les années 90 et qui au sein des laboratoires de biologie moléculaire a trouvé une application largement répandue sous la forme des puces Agilent consommables pour BioAnalyzer. La technologie d’Agilent, basée sur une électrophorèse ou une cytométrie de flux microfluidique, offre un outil de contrôle de la quantité, qualité (distribution de taille, intégrité des ARNs extraits etc.) des molécules considérées. Même si les puces Agilent sont affublées du qualificatif de « Lab-on-Chip« , elles nécessitent un appareillage dédié et bien entendu un PC relié. L’outil est encore loin du modèle rêvé, c’est-à-dire complètement autonome (en une version « stand alone »).

L’émergence de ce type de laboratoires a été, en partie, permise grâce à des budgets alloués à la lutte contre le bioterrorisme. En effet, des laboratoires qui tiennent dans une poche de treillis, qui peuvent être employés sur n’importe quel théâtre d’opération, peuvent venir parfaire le paquetage des experts en sécurité intérieure. Les laboratoires Sandia (Sandia National Laboratories) font partie des principaux laboratoires nationaux du département de l’Énergie des États-Unis et sont des pionniers de ces applications avec les développements réalisés par MicroChemLab qui est actif depuis 1988 sur ce type de développements.

Aujourd’hui les laboratoires unipersonnels de diagnostic embarqués sont devenus très populaires, pour des applications liées à des analyses biochimiques. L’un des exemples les plus fameux concerne le BG-Star (Sanofi Diabète) permettant de réaliser en quelques secondes, très aisément, des lectures de glycémie. L’outil est basé sur le principe de l’électrochimie dynamique où une bandelette jetable accueille une goutte de sang qui vient activer une glucose oxydase.

Les avantages de ce type de technologies :

– Une faible consommation de volume de fluide, en raison des volumes internes  faibles des puces, ce qui minimise la quantité de déchets, baisse des coûts des réactifs onéreux et surtout minimise la quantité nécessaire d’échantillon de départ

– Une rapidité d’exécution où l’efficacité des réactions biochimiques est permise par la miniaturisation de l’outil, en effet la taille du dispositif ne nécessite qu’une faible quantité d’énergie pour fonctionner

– Un meilleur contrôle du processus en raison d’une réponse rapide du système (par exemple, le contrôle thermique pour des réactions chimiques exothermiques)

– Une parallélisation massive due à la compacité, qui permet l’analyse à haut-débit

– Une réduction des coûts de fabrication, permettant une utilisation de puces jetables, un processus qui deviendra rentable s’il est fabriqué en masse

– Une plateforme plus sûre pour les produits chimiques, les études radioactives ou biologiques en raison de la grande intégration du système (souvent en système clos), des faibles quantités de réactifs et d’échantillons nécessaires

Les vertus de la miniaturisation ne nécessitent pas plus amples apologies ! Depuis quelques années l’idée d’un laboratoire qui tient au creux de la main a réellement commencé à voir le jour.

Des exemples de ces laboratoires portatifs commencent à poindre dans des versions de plus en plus intégrées.

Ainsi la technologie Mondrian développée par NuGEN, technologie basée sur de la microfluidique digitale, permet de simplifier les étapes de constitution de librairie de séquences haut-débit.

Destinagenomics propose un système analytique ne faisant pas intervenir d’enzymes. Ce système fait intervenir des sondes interrogatives de mutations que la société souhaite embarquer dans des puces : la preuve du concept a été publiée par  Pernagallo et al. (Sensors (Basel). 2012).

http://youtu.be/k-NnBS2xDLo

Panasonic, le groupe japonais, numéro 4 mondial de l’électronique, en partenariat avec la société belge, Imec, propose d’embarquer dans une puce d’ 1 cm2 : une pompe permettant aux fluides de circuler, une unité d’extraction d’ADN à partir de la goutte de sang prélevée, un thermocycleur, une unité de purification de produits de PCR, et un système de détection de SNPs.

Le concept est séduisant, mais pour être viable et concurrencer les coûts de génotypages basse densité qui sont relativement bas (quelques euros / marqueur), les concepteurs des Laboratoires sur Puces misent donc sur une large diffusion de leur produit. Ainsi la production de masse impacte drastiquement le coût de production qui lui-même est impacté sur le prix vente… un prix de vente attractif et une simplicité d’utilisation qui dope les ventes… et donc fait baisser les coûts de production…

Le pari réside dans le fait d’amorcer ce cercle vertueux, en quelque sorte chaque opérateur du marché – au niveau d’une application donnée- souhaite assommer la concurrence ! Une course au développement est donc lancée.

Revenons à la science ! Vous trouverez ici le document pdf. présentant la technologie de Panasonic/Imec,

Concernant l’application de séquençage, Oxford Nanopore proposera une « clé USB » capable de séquencer, le Minion.

Dans le futur il est envisageable, d’imaginer un outil combinant la technologie de séquençage de 3ème génération, d’un Oxford Nanopore, par exemple, avec en amont un dispositif intégrant (à l’instar du projet de Panasonic), une micro-pompe, un réseau microfluidique permettant d’alimenter en échantillon et réactifs les différents éléments permettant une extraction d’ADN/ARN, la constitution d’une librairie, une purification…

Parle-t’on ici de science fiction  ? Pour un début de réponse, il faut comprendre que séparément toutes ces solutions technologiques existent déjà.

Pour les plus férus de laboratoires miniaturisés, un journal scientifique est là pour eux, explicitement nommé : Lab on a Chip.

Ce post fait naturellement suite à celui dédié à la seconde génération de séquenceurs multi-parallélisés, et conserve la même approche, à savoir un tour d’horizon des technologies et une évocations des informations générales sur le sujet.

A l’instar du PGM de Ion torrent mis sur le marché depuis un an (10Mb – reads 100b – 06.2011 / 100Mb – reads 200b -11.2011 / 1Gb – reads 400b – prévu début 2012), la seconde génération de séquenceurs haut débit tend vers une production de reads de plus en plus longs et de moins en moins chère. Toutefois, on est en droit de se demander quelle sera leur pérennité face à la 3éme génération répondant à un cahier des charges assez similaire et la possibilité de bénéficier de nouvelles applications.

 

Le principe de la 3ème génération peut être symbolisé par le séquençage d’une molécule d’ADN sans étape de pré-amplification (contrairement à la génération actuelle type 454 Roche, SOLiD Life technologie, Ion Proton, PGM Ion torrent, HiSeq Illumina, …) en conservant l’incorporation de nucléotides, par cycles ou non ( dans ce dernier cas, le terme de « Séquençage d’ADN simple molécule en temps réel » est approprié).

Les technologies « SMS » pour « Single Molecule Sequencing » peuvent être regroupées selon trois catégories:

– Technologies de séquençage en temps réel impliquant la synthèse du brin d’ADN complémentaire via une ADN polymérase.

– Technologies de séquençage par détection des bases successives d’une molécule d’ADN au travers de nanopores.

– Technologies de séquençage basées sur des techniques de microscopie.

En combinant les dernières avancées dans la nanofabrication, la chimie de surface et l’optique, Pacific Biosciences (Pacbio RS) a lancé une plateforme technologique puissante appelée technologie de molécule unique en temps réel, ou « SMRT » pour « Single Molecule Real-time sequencing ». Parmi ses concurrents directs, Helicos Biosciences (Helicos) qualifié  « tSMS » pour « True Single Molecule Sequencing ». Malgré le recours à une technologie analogue, la mention « Temps réel » auquel il échappe est simplement liée à une incorporation cyclique des nucléotides fluorescents.

D’autres technologies, à des degrés de développement plus ou moins avancé, sont dans les tuyaux et qui sait de Noblegen, Starlight, Cracker Bio, NABSys, Halcyon, ou autres…  révolutionnera encore un peu plus cet univers du haut débit et suivra le chemin emprunté dernièrement par Oxford Nanopore

 

Historique schématique du séquençage d’acide nucléique

Un bref historique des évolutions du séquençage de l’ADN permet de comprendre ce que certains nomment révolution technologique… certainement concernant l’univers de la biologie moléculaire une innovation comparable à celle la PCR.

 

Allan Maxam , Walter Gilbert (USA) et Frederick Sanger (Royaume-Uni), les pionniers de la conquête de la séquence, ont mis au point deux méthodes très différentes permettant d’accéder à la lecture de la séquence. Maxam, Gilbert ont exploité des stratégies de dégradation chimique sélective quand Sanger choisit une stratégie de synthèse enzymatique sélective. Pour ces découvertes, Gilbert et Sanger ont été récompensés par le prix Nobel de chimie en 1980. L’histoire ne retient effectivement que Sanger, à juste titre, puisque cette stratégie bénéficiant de l’invention de laPCR (invention de Kary Mullis publiée en 1986, lui aussi nobélisé par le prix de chimie en 1993) et du développement de l’électrophorèse capillaire, permettant de simplifier la partie séparative et analytique. C’est ainsi que des sociétés comme Perkin Elmer, Beckman Coulter et Applied Biosystem ont investi le marché sur le principe même du séquençage Sanger sans le révolutionner mais en permettant son automatisation et l’augmentation du nombre de réactions de séquences analysables par jour. Une fois amorti le coût des séquenceurs, le coût de revient d’une séquence n’a cessé de baisser permettant de banaliser l’accès à la séquence.

Bien que se montrant de plus en plus performant, des applications comme le séquençage complet de génomes eucaryotes supérieurs, les approches métagénomiques (nécessité de cloner), les études de modulation de transcrits (la méthode SAGE les permettait sur la base du séquençage Sanger, cette méthode est lourde et nécessite toujours une phase de clonage) ont connu des limites quasi infranchissables (méthodes nécessitant trop de temps et de capitaux). Prenons à titre d’exemple les projets de séquençage du génome humain. Ces projets auront nécessité plus de 10 ans de travail et de 300 millions de USD pour le projet privé de Celera et un peu moins de 3 milliards de USD pour le projet HUGO (HUman Genome Organisation), le match entre Craig Venter (fondateur de Celera avec le soutien de Perkin Elmer) et James Watson (premier directeur du NIH coordinateur du consortium international) se solde par un match nul entaché de polémiques avec les publications en 2001 des premières séquences du génome humain.

L’année 2005 a connu à grands bruits, l’arrivée de nouvelles méthodes de séquençage à haut débit. Ces méthodes de séquençage massif font appel aux techniques de clonage et d’amplification moléculaire, leur spécificité relevait de leur stratégie de lecture.

En effet, la société 454 (rachetée par Roche en 2007), utilise des méthodes de pyroséquençage (luminescence par libération de pyrophosphate) de fragments d’ADN isolés dans des micro-gouttes comme micro-réacteur de PCR isolés au sein d’une émulsion, la société Solexa (rachetée par Illumina en 2007), utilise des méthodes d’amplification sur support solide permettant l’incorporation de bases terminateurs de chaîne réversibles marqués par des fluorochromes. La société Agencourt  (rachetée par Applied Biosystem en 2006), a quant à elle basé son système de détection sur le principe de l’amplification par émulsion et hybridation-ligation chimique.

Depuis 2007, une certaine frénésie s’empare du monde de la biologie moléculaire, un très grand nombre de machines que l’on qualifie tour à tour de NGS (Next Generation Sequencing), HTS (High Throughput Sequencing), ou encore de manière plus appropriée sequençage multi-parallélisé se trouvent disponibles et évoluent vers le plus de profondeur, ou vers le moindre coût, rendant obsolètes les versions précédentes (la société Illumina à titre d’exemple depuis le rachat de Solexa a lancé un modèle de séquenceur tous les ans).

Cette révolution technologique est sortie des laboratoires pour attirer l’attention d’investisseurs et autres banquiers conscients qu’une ruée vers l’or accompagnant la ruée vers la séquence pouvait s’engager. Dans ce sens nous mettons à disposition un document datant de 2007 réalisé pour le compte de la Deutsche Bank (ce document très complet a été co-réalisé par nombre de consultants en biotechnologies, il permet de décortiquer assez finement les 3 technologies présentes sur le marché à partir de 2005 et de montrer les attentes des mondes scientifique et financier)

Afin de terminer ce bref tour d’horizon il semble nécessaire de hiérarchiser ces nouvelles technologies. Il est possible de distinguer tout d’abord deux grands groupes : les technologies sans amplification (permettant de séquencer une seule molécule d’adn matriciel, citons exemple de la technologie SMRT de Pacific Biosciences, la technologie tSMS de Helicos Biosciences ou encore celle toujours en développement mais très attendue développée par Oxford Nanopore) et avec amplification (toutes les technologies amplifiant une matrice clonale d’adn issu d’une librairie)

Parmi cette seconde classe, il est possible de distinguer trois grandes classes de matériel :

–       les usines à produire de la séquence (type Hiseq 2000 de Illumina permettant de séquencer jusqu’à 200 Gb par run de 8 jours

–       les séquenceur de paillasse (type PGM de IonTorrent de taille et prix beaucoup plus modeste permettant de réaliser des run autour de 100 Mb avec une perspective de 1 Gb pour début 2012)

–       les séquenceurs haut débit en voie d’obsolescence (454 de Roche, les versions des séquenceurs Illumina antérieures au HiSeq 1000 etc.)

Cet historique est bien entendu un prétexte pour planter le décor et présenter les forces en présence. Après l’âge des pionniers (Maxam et Sanger), celui de la douce exploitation (séquenceur capillaire) vient celui de l’accélération que certains nomment révolution… ces technologies marquent quoi qu’il en soit un tournant pour la génomique et pour les applications actuelles et en devenir qui y sont liées. Enfin la diffusion de ces technologies va de paire avec un changement de physionomie des laboratoires : la biotechnologie est  une science composite où bio-informatique, biologie cellulaire et moléculaire mais aussi physique et statistique deviennent de plus en plus interdépendantes.

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Une jeune start-up est née en mai 2012 : cette société issue du CNRS est porteuse d’une innovation dans le secteur du séquençage haut-débit. Enfin, une alternative française aux anglosaxons qui  sont présents sur le marché depuis une dizaine d’année ! Maintenant… espérons que ce nouveau né n’arrive pas trop tard sur un marché animé par des fournisseurs de séquenceurs de 2ème génération (un marché mature) et d’autres fournissant des solutions de 3ème génération, riches de promesses.

PicoSeq derrière ce nom emprunt d’humilité se cache une technologie de séquençage des plus ingénieuses : en effet, SIMDEQ™ (SIngle-molecule Magnetic DEtection and Quantification) la technologie de PicoSeq utilise une approche biophysique pour extraire des informations à partir de la séquence d’ADN ou d’ARN.

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En s’appuyant sur cette représentation schématique tirée de Ding et al. (Nature Methods, 2012), on y voit un peu plus clair. Des fragments d’ADN ou d’ARN que l’on souhaite analyser servent de matrice pour la réalisation d’une librairie en «épingle à cheveux». Pour chaque épingle à cheveux, un côté d’un brin d’acide nucléique est attaché sur une surface solide plane et l’autre à une bille magnétique. En plaçant les billes dans un champ magnétique, modulant celui-ci de manière cyclique, les épingles à cheveux peuvent être auto-hybridées ou non (zip ou unzip). Ce processus peut être effectué des milliers de fois sans endommager les molécules constitutives de la librairie. La position de chaque bille est suivie à très haute précision permettant de voir ce processus d’ouverture et de fermeture en temps réel: nous avons donc là un signal brut permettant, en fonction de la force appliquée pour ouvrir totalement l’épingle à cheveu et des séquences d’oligonucléotides séquentiellement introduites dans le système de modifier la distance bille-support et de jouer sur le temps nécessaire où la force s’applique pour ouvrir l’épingle à cheveu…

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La figure ci-dessus (présente dans les données supplémentaires de l’article sus-cité) permet d’appréhender le potentiel de discrimination de la méthode… où le temps de blocage est fonction du nombre de mésappariements et de la position de ces mésappariements…

Finalement si l’aspect technique est intéressant puisqu’en rupture avec les méthodes proposées par PacBio certainement un peu moins avec le système proposé par Oxford Nanopore Technologies, si la perspective annoncée par PicoSeq est réellement séduisante: l’accès modifications épigénétiques de l’ADN, la question centrale est de savoir si le pas de la commercialisation (dans des conditions propices au succès) d’un tel outil, sera franchi.

Un article d’ Atlantico de septembre 2015, titré : les trois raisons pour lesquelles la France est incapable de rivaliser avec les géants américains de l’analyse ADN, est assez éclairant pour imaginer comment la concrétisation d’une preuve de concept peut être un chemin ubuescokafkaïen. Pour illustrer cela les propos de Gordon Hamilton, le directeur de la startup PicoSeq qui s’inquiète sur les entraves « typically french » peuvent faire office de témoignage. Ce dernier s’inquiète : « La qualité de la recherche scientifique (en France) est incroyable, l’une des meilleures » « le seul souci, c’est que l’on a beaucoup de difficultés ici à transformer ces recherches en vrai business » pour finir par citer en exemple les lenteurs administratives spécificités latines : « nous avons mis presque deux ans pour négocier les licences nécessaires aux brevets de Picoseq. Le même processus en Californie prend entre deux semaines et deux mois. Sur un marché aussi rapide que celui-ci, deux ans c’est très long. Tout change vite, c’est donc impossible pour nous d’être de sérieux concurrents de ces sociétés américaines qui ont toujours un temps d’avance ».

Oxford Nanopore Technologies (ONT) crée un nouveau marché pour le séquençage haut-débit: le séquençage (haut-débit ?) à la portée de tous et en mode tout-terrain… mais pourquoi faire ? Le principe de cette technologie a été abordé dans plusieurs de nos articles : les données produites sont constituées de longs reads (quelques milliers de bases frôlant les 10 kB de moyenne), des reads assez bruités au-delà de 10 % d’erreurs; suffisamment longs pour permettre une identification quasi-certaine mais encore trop bruité (et trop peu profond dans le format portable MinION et maintenant SmidgION) pour pratiquer un bel assemblage de novo.

Donc imaginez vous, perdu au fin fond de l’Amazonie à la recherche de cette plante évoquée par le « sorcier » de la tribu Mashco-Piro que vous venez de quitter, plante potentiellement inconnue de notre médecine occidentale… Qu’à cela ne tienne! vous marchez en quête de la dite plante, vous, votre panneau solaire, votre smartphone, vos appareils ONT (Voltrax + SmidgION). Quasi certain de vérifier in situ votre trouvaille à l’aide d’un séquençage de 3ème génération. Enfin, ceci serait parfait si l’on oublie que Metrichor (le BaseCaller d’ONT) fonctionne en ligne… (cf schéma ci-dessous)… malgré les rêves les plus fous de Google et autres Facebook le fin fond de l’Amazonie n’est pas couvert par la 4G ! On peut imaginer qu’une application pour nos téléphones intelligents devra accompagner la mise sur le marché de cette suite d’appareils pour permettre une analyse en mode stand alone.

 

SmidgION

METRICHOR
VolTRAX, l’une des promesses d’ONT, permet d’envisager la préparation de librairies à séquencer, ceci même perdu en pleine brousse. Par exemple, les nouveaux kits développés permettent une préparation d’une librairie en une dizaine de minutes. Que vous deviez séquencer un isolat du virus Zika ou Ebola sur le terrain (la logistique et le temps sont comptés) ou que vous deviez séquencer dans votre laboratoire favori, ce type d’automates permettant de simplifier les opérations relatives à l’élaboration de librairies de séquençage est souvent bien accueillis par les techniciens qui pourront s’adonner à des activités plus pertinentes.

 
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