Types d'altérations génomiques détectées par séquençage haut débit

Le séquençage massif parallélisé palliant les limites des anciennes méthodes, a depuis ces dernières années amorcé de nouvelles perspectives, comme l’étude d’altérations génomiques pour la compréhension de nombreuses maladies rares (Plan National Maladies Rares). De plus, la mise sur le marché des derniers séquenceurs de paillasse aux visées hospitalières (positionnement de marché de Ion torrent avec son PGM) contribue également au développement de nombreux diagnostics cliniques.

Face à cette révolution, il convient de faire face au goulot d’étranglement de l’analyse et de l’interprétation, en faisant appel à une stratégie plus appropriée que le séquençage de génome complet et qui consiste à focaliser les efforts de décodage sur les régions codantes enrichies (Exome, gènes cibles, etc…) par une étape préliminaire de d’enrichissement d’exons. Tout en contribuant à une diminution des coûts (on ne séquence que ce qui semble pertinent…), elle permet entre autre d’augmenter la profondeur de séquençage des régions d’intérêts, paramètre indispensable pour l’identification d’altérations génomiques.

Succinctement, les techniques d’enrichissement sont multiples et peuvent être regroupées en trois catégories sur la base de leur principe technique:

– Enrichissement par capture d’hybrides : La capture par hybridation des régions cibles est initiée à  partir de la librairie de séquençage. Elle peut être effectuée soit en solution (billes magnétiques) soit sur support solide (microarrays). Récemment, de nombreuses solutions (commerciales ou « à façon ») ont été développées: SureSelect, Agilent – SeqCap EZ, Roche NimbleGen – Sequence Capture Arrays, Roche Nimblegen –  FleXelect, FlexGen – MYselect, MYcroarray – TargetSeq, Life Technologies .

– Enrichissement par circularisation de fragments d’ADN : Cette méthode est supérieure à la précédente en terme de spécificité. En amont de la préparation de la librairie, les fragments d’ADNg (fragmentation enzymatique ou mécanique selon la méthode) sont enrichis via une  sonde constituée d’une séquence universelle flanquée aux extrémités de séquences spécifiques de  la région cible. HaloPlex, Agilent.

– Enrichissement par PCR : Cette approche intervient avant la préparation de la librairie  et consiste grossièrement en une PCR multipléxée ciblant les régions d’intérêts. Une étape préliminaire de design des amorces est requise.  SequalPrep, Life technologies. Tout juste disponible, Ion AmpliSeq Designer, Life Technologies propose un PCR Ultra-Plex (jusqu’à 1536 amplicons) avec un étape de digestion des amorces permettant de ne conserver que les régions d’intérêts lors du séquençage.

Une technologie  récente et élégante  faisant appel à la microfluidique et l’émulsion PCR permet  l’amplification multipléxée (jusqu’à 20000) en micro-gouttelettes (une paire d’amorces par microréacteur) en un seul tube. Multiplicom, Fluidigm – RainDance.

Ceci étant,  les considérations fondamentales dans l’analyse de variants résident notamment dans:

– la profondeur de séquençage

– l’homogénéité de couverture des régions d’intérêt

– la reproductibilité de la méthode

– la quantité d’ADN « Input » requis

– le nombre d’échantillons à traiter

– le coût global

L’étude récemment menée par Florian Mertes et al. (nov. 2011) souligne l’importance de ces notions et fait le postulat de performances de captures de régions cibles significativement différentes selon la méthode d’enrichissement employée.

Il est impossible d’identifier une méthode d’enrichissement comme étant la meilleure notamment parce que ces approches sont en continuelle évolution et amélioration. Chacune d’elles répondent à des caractéristiques particulières  et à des applications distinctes.

Si l’enrichissement par circularisation offre davantage de spécificité mais moins d’uniformité, l’inverse est aussi valable pour l’enrichissement par capture d’hybrides. Parmi les considérations dans le choix d’une méthode, le nombre d’échantillons et la taille des régions cibles sont essentiels. Si la capture d’hybrides est privilégiée pour l’analyse de mégabases (étude de l’exome) avec un nombre limité de cas, cette méthode sera délaissée au profit d’une approche PCR multipléxée pour l’étude d’un nombre restreint de régions cibles de petite taille appliquée à un grand nombre d’échantillons (Diagnostic).

L’association des méthodes d’enrichissement au séquençage haut débit offre des capacités technologiques ouvrant la voie vers de nombreuses perspectives. Toutefois, si l’émergence des séquenceurs de troisième génération s’accompagne à nouveau d’une diminution des coûts de séquençage, on est en droit de se demander si cette option restera aussi attractive.