La HRM, une technique négligée à haute résolution

La HRM est une technique accessible (en temps/finance) sous diffusée. Loin d’avoir l’ambition de réparer cette injustice (à mes yeux), cet article vise à aborder une technique analytique de biologie moléculaire survolée, méconnue et snobée à l’heure de la biologie haut-débit.

La HRM (High Resolution Melt, Courbe de Fusion à Haute-Résolution) permet de distinguer des amplicons (produits PCR) variant d’un minimum de 1 base… (avec plus ou moins de difficulté selon que la mutation concernée est une transversion A/T ou un INDEL par exemple). Cette technique est l’alliance de machine qPCR permettant un contrôle fin de la température (pour ce qui nous concerne nous sommes les heureux possesseurs d’un RotorGene 6000, de Corbett dorénavant vendu sous le nom de Rotor-Gene Q, Qiagen) et d‘agents intercallants de l’ADN saturants et moins « toxiques » pour la PCR comme peut l’être l’EvaGreen. Au rayon des molécules fluorescentes pour cette application vous pourrez trouver le LC Green et LC Green Plus , le ResoLight, Chromofy, SYTO 9 et le SybrGreen I bien sûr ! (de toute évidence sur la plateforme RotorGene, cette molécule permet de bons résultats). Ainsi que le montre les courbes ci-dessous, après amplification, les produits de PCR sont chauffés jusqu’à complète dénaturation par pas de température les plus fins possibles, plus ceux-ci sont petits, plus la technique est résolutive. Le point d’inflexion (l’endroit où la dérivée s’annule) reporté en abscisses est le Tm du produit PCR préalablement amplifié. Or le Tm d’un produit PCR est dépendant de sa concentration, de la concentration en sels du milieu dans lequel il est solubilisé mais surtout de sa composition en bases azotées.

L’hétéroduplexe (la forme hétérozygote) montrera une courbe avec 2 points d’inflexions (ainsi que vous pouvez l’observer sur la courbe ci-dessus). Les 3 populations : homozygotes AA et BB, ainsi que la forme hétérozygote AB se distinguent entre elles.

Au niveau des stratégies de design puis d’analyse, un document plutôt bien réalisé est disponible ici. Les plateformes permettant de réaliser de « vraies » courbes HRM possèdent un logiciel permettant une normalisation qui facilite grandement l’interprétation des résultats.

Les applications de cette techniques sont évidentes :

– le génotypage à bas débit et très bas coût : de simples amorces suffisent (nul besoin de sondes internes doublement marquées) un mastermix contenant un fluorochrome et le tour est joué (il sera judicieux d’avoir sous la main des échantillons références homozygote des deux formes, au minimum). Bien designé, ce diagnostic de génotypage permet une discrimination des substitutions A/T (SNP de classe 4) les plus difficiles à distinguer compte tenu de la faible différence de Tm (autour des 0,2 °C) entre les deux formes.

– le criblage (screening) de mutants : cette application permet de réaliser un premier filtre en vue d’un séquençage (par exemple) sur des zones courtes de l’ADN potentiellement impliquées dans un phénotype particulier. La reproductibilité et la sensibilité de la technique est correcte comme le montre l’article Tù Nguyen-Dumont et al., BMC 2011

– méthylation de l’ADN : recherche de base 5-méthylcytosine (à l’aide d’un protocole bi-sulfite permettant de « remplacer » les cytosines non méthylées par des uraciles) à l’instar de ce que développe la publication dans NAR de Tomasz K. Wojdac et Alexander Dobrovic. Cette étude montre que l’intermédiaire de la MS-HRM (Methylation-Sensitive High Resolution Melting) il est possible de distinguer des zones méthylées à 0,1 % (ainsi que les courbes tirées de l’article sus-cité montrent pour des sensibilités descendant jusqu’à 1% d’amplicons méthylés, visibles ci-dessous).

En conclusion, la HRM est une technique largement méconnue et sous-employée, relativement simple à développer. Il est nécessaire de normaliser la concentration des échantillons (afin que ceux-ci aient des courbes d’amplification franchissant le seuil autour des 25 Ct). Dans l’idéal, la concentration en sels ne doit pas varier entre les échantillons… appuyé sur un bon design… et le tour est joué. De plus amples informations sont disponibles sur le site gene-quantification.info (la référence en matière de qPCR) ainsi que sur le site highresolutionmelt.co.uk.