A l’aube des années 2000, la génomique appliquée au domaine végétal fait l’objet d’une mobilisation internationale de grande ampleur comme en témoignent les programmes « Zygia » et « Gabi » en Allemagne, « Plant Genome Initiative » aux États-Unis, ou encore « Rice Genome Research Program » au Japon, qui poursuivent des objectifs analogues. Il devient primordial d’identifier les gènes et leur fonction jouant notamment un rôle décisif dans la production végétal (Rusticité, résistance aux maladies, aux herbicides, etc…).

Cette période est également marquée par l’achèvement du séquençage du génome de la plante modèle Arabidopsis thaliana, étape majeure dans la recherche en biologie végétale.

Simultanément, des collections de mutants d’insertions (T-DNA) chez A. thaliana sont créés au sein de nombreux groupes (SALK, GABI-Kat, Syngenta, INRA Versailles, etc…), et elles émergent notamment au travers du projet « Genoplante« , programme fédérateur en génomique végétale (Groupement d’Intérêt Scientifique regroupant à la fois des organismes publics tel que l’INRA, CNRS, Cirad, IRD et de puissants partenaires privés tel que Biogemma, Rhône-Poulenc Santé végétale et animale et Bioplante). L’idée est donc d’utiliser ces banques de mutants comme outils pour la génomique fonctionnelle appliquée à la plante modèle.

A l’époque, les solutions proposées pour l’identification des positions d’insertion du T-DNA au sein du génome sont nombreuses ( « Tail-PCR », « Inverse PCR », « Kanamycin Rescue » ). Néanmoins, ces approches restent fastidieuses: En plus de présenter certaines étapes techniques limitantes, elles sont également très chronophages.

Récemment, de nombreuses études ont commencé a démontrer l’énorme potentiel du séquençage à haut-débit dans l’identification des sites d’insertion de transposons. Le terme générique « Tn-Seq », pour « Transposon-Sequencing », est une variante du séquençage d’amplicons ciblés (Target-seq) et peut se décliner selon quatre méthodes comme illustrées ci-dessous (Tim van Opijnen and Andrew Camilli, Nature reviews – Microbiology (2013 July)). Elles dépendent notamment de la procédure de préparation de librairie de séquençage employée:

– Le »Tn-seq » et « INSeq » (respectivement pour « Transposon sequencing » et « Insertion sequencing ») sont deux approches très similaires reposant sur un séquençage d’amplicons obtenus à partir d’un couple d’oligos dont l’un cible le transposon. Seule la méthode de purification varie (Gel PAGE pour « INSeq » et Gel agarose pour « Tn-Seq)

– Le « HITS » et « TraDIS » (respectivement pour « High-throughput insertion tracking by deep sequencing » et « Transposon-directed insertion site sequencing ») sont également deux méthodes très similaires notamment en amont de l’étape de PCR de librairie.

L’alignement des données de séquençage (.fastq) sur le génome de référence, permet ainsi d’identifier la position du site d’insertion. L’illustration met en évidence les « reads » issus de la PCR de librairie ciblant les régions flanquantes au Transposon (« En vert » la bordure gauche, « en rouge » la bordure droite). Sur la base de cette méthode, il devient donc aisé d’identifier le nombre d’insertion potentielle.

L’utilisation des technologies de séquençage à haut-débit pour l’identification des sites d’insertion de T-DNA dans les banques de mutants révolutionnent les méthodes de criblage. Tout en s’affranchissant de techniques fastidieuses, cette approche de Tn-seq présente à la fois l’avantage de pouvoir gérer simultanément un très grand nombre d’échantillons (barcoding), à des coûts réduits et dans un délai des plus respectables.