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Parmi les technologies dédiées à la génomique, l’ « Optical Mapping » fait figure d’outil qualifiable d’alternatif. Cette approche repose sur une représentation graphique des sites de restrictions enzymatiques au travers d’un génome complet.

Les applications concernent aussi bien la génomique comparative (détection des délétions, insertions, inversions ou translocations),  que le typage de souches (comparaison des cartes de restrictions). Aussi, conjuguée aux technologies de séquençage à haut-débit, elle permet également de répondre aux illusions fréquentes de l’obtention d’un « draft » de génome d’intérêt, nouvellement séquencé. Actuellement, OpGEN est la seule société proposant une solution semi-automatisée de cette technologie.

Techniquement, l’ « Optical mapping » consiste en (Cf fig ci-dessous):

– Une immobilisation des fragments d’ADN génomique extraits (1) au sein de canaux intégrés dans un support dédié (Argus System – OpGen) (2).

– Chaque molécule subit une digestion enzymatique (endonucléase de restriction) générant des sites de clivage, symbolisés ci dessous par les espaces (3).

– Le logiciel d’analyse (MapSolver) convertit ces données optiques en cartes moléculaires unitaires (4), qui alignées, fournissent une carte de restriction consensus du génome étudié (5).

L’utilisation de cette méthode, dans la perspective d’un assemblage efficace de génome, ne cesse de croître. En effet, elle permet de pallier les limites des NGS  (Homopolymères, zones de génome peu ou non couvert) qui ne permettent bien souvent d’aboutir qu’à un nombre restreint de contigs (3′).

Il convient alors de créer une carte de restriction, in silico, de ces contigs (4′), à leur tour alignés sur l’ « optical map » du génome, sur la base des sites de clivage. Cette comparaison permet alors de positionner les contigs entre eux, de les orienter et de mettre en lumière les hypothétiques gaps. Le scaffold des contigs ainsi établi, associé à un séquençage Sanger des gaps permettent ainsi d’aboutir à un « draft » du génome étudié.

L’ « optical mapping » apparait comme un outil fiable et utile dans l’assemblage de génome, d’autant qu’il fait appel à une technique différente, indépendante mais à la fois très complémentaire au séquençage à haut débit.

A l’aube des années 2000, la génomique appliquée au domaine végétal fait l’objet d’une mobilisation internationale de grande ampleur comme en témoignent les programmes « Zygia » et « Gabi » en Allemagne, « Plant Genome Initiative » aux États-Unis, ou encore « Rice Genome Research Program » au Japon, qui poursuivent des objectifs analogues. Il devient primordial d’identifier les gènes et leur fonction jouant notamment un rôle décisif dans la production végétal (Rusticité, résistance aux maladies, aux herbicides, etc…).

Cette période est également marquée par l’achèvement du séquençage du génome de la plante modèle Arabidopsis thaliana, étape majeure dans la recherche en biologie végétale.

Simultanément, des collections de mutants d’insertions (T-DNA) chez A. thaliana sont créés au sein de nombreux groupes (SALK, GABI-Kat, Syngenta, INRA Versailles, etc…), et elles émergent notamment au travers du projet « Genoplante« , programme fédérateur en génomique végétale (Groupement d’Intérêt Scientifique regroupant à la fois des organismes publics tel que l’INRA, CNRS, Cirad, IRD et de puissants partenaires privés tel que Biogemma, Rhône-Poulenc Santé végétale et animale et Bioplante). L’idée est donc d’utiliser ces banques de mutants comme outils pour la génomique fonctionnelle appliquée à la plante modèle.

A l’époque, les solutions proposées pour l’identification des positions d’insertion du T-DNA au sein du génome sont nombreuses ( « Tail-PCR », « Inverse PCR », « Kanamycin Rescue » ). Néanmoins, ces approches restent fastidieuses: En plus de présenter certaines étapes techniques limitantes, elles sont également très chronophages.

Récemment, de nombreuses études ont commencé a démontrer l’énorme potentiel du séquençage à haut-débit dans l’identification des sites d’insertion de transposons. Le terme générique « Tn-Seq », pour « Transposon-Sequencing », est une variante du séquençage d’amplicons ciblés (Target-seq) et peut se décliner selon quatre méthodes comme illustrées ci-dessous (Tim van Opijnen and Andrew Camilli, Nature reviews – Microbiology (2013 July)). Elles dépendent notamment de la procédure de préparation de librairie de séquençage employée:

– Le »Tn-seq » et « INSeq » (respectivement pour « Transposon sequencing » et « Insertion sequencing ») sont deux approches très similaires reposant sur un séquençage d’amplicons obtenus à partir d’un couple d’oligos dont l’un cible le transposon. Seule la méthode de purification varie (Gel PAGE pour « INSeq » et Gel agarose pour « Tn-Seq)

– Le « HITS » et « TraDIS » (respectivement pour « High-throughput insertion tracking by deep sequencing » et « Transposon-directed insertion site sequencing ») sont également deux méthodes très similaires notamment en amont de l’étape de PCR de librairie.

 

L’alignement des données de séquençage (.fastq) sur le génome de référence, permet ainsi d’identifier la position du site d’insertion. L’illustration met en évidence les « reads » issus de la PCR de librairie ciblant les régions flanquantes au Transposon (« En vert » la bordure gauche, « en rouge » la bordure droite). Sur la base de cette méthode, il devient donc aisé d’identifier le nombre d’insertion potentielle.

 

L’utilisation des technologies de séquençage à haut-débit pour l’identification des sites d’insertion de T-DNA dans les banques de mutants révolutionnent les méthodes de criblage. Tout en s’affranchissant de techniques fastidieuses, cette approche de Tn-seq présente à la fois l’avantage de pouvoir gérer simultanément un très grand nombre d’échantillons (barcoding), à des coûts réduits et dans un délai des plus respectables.

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