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Ce poste a vocation de passer en revue les différentes étapes de la technologie de séquençage à haut-débit du PGM Ion Torrent, depuis la préparation de la librairie jusqu’à l’obtention des données brutes. Ce survol technologique permet de rassembler un maximum d’explications techniques et de termes clefs associés à cette technologie. L’intérêt est de répondre essentiellement à une attente de néophytes ou futurs utilisateurs du PGM friands de retours d’expériences.
L’arbre de décision Ion Torrent s’étant considérablement développé, seuls les axes « Whole genome » et « Amplicon » serviront de support à l’ensemble de la présentation.
Préparation de la librairie
La finalité d’une préparation de librairie pour le PGM Ion Torrent est de lier aux fragments d’ADN à séquencer le couple d’adaptateurs A et P1. La taille médiane des fragments est variable et définie selon la chimie employée: 100, 200 , 300 ou 400 bases (Cf tableau ci-dessous).
Le traitement d’un échantillon d’ADN génomique débute par une étape de fragmentation mécanique ou enzymatique. Cette dernière présente l’avantage d’être considérablement plus rapide.
En amplicon-seq, la méthode pour flanquer les adaptateurs est double, par ligation ou par fusion PCR.
Par ailleurs, il est envisageable de traiter plusieurs échantillons en parallèle en utilisant des adaptateurs avec code barre ( En standard chez Life technologies: Au nombre de 96 pour les échantillons ADN et 16 pour les échantillons ARN).
La librairie est monitorée sur puce DNA High sensitivity (Bioanalyzer, Agilent) avec comme objectifs de calculer sa concentration et d’identifier la taille moyenne des fragments qui la composent. Ces valeurs permettront ainsi de déterminer la concentration molaire de la libairie et d’y appliquer le facteur de dilution nécessaire pour favoriser le ratio idéal 1/1 (Fragment ADN de la librairie/Ion Sphere Particle) pour l’étape suivante de PCR en émulsion.
Monitoring de librairie PGM sur Puce DNA High sensitivity (Bioanalyzer)
Préparation de la matrice de séquençage
Cette étape automatisée permet l’amplification clonale (OneTouch2) suivi d’un enrichissement en « Ion Sphere Particles » (ISPs) à la surface desquelles un fragment de librairie est amplifié (OneTouch ES).
L’amplification clonale est réalisée au cours de la PCR en émulsion (emPCR) et contribuera à atteindre un seuil de détection du signal nécessaire et suffisant au moment du séquençage. Malgré une optimisation du ratio 1/1 (ISP / Fragment ADN), plusieurs configurations de microréacteurs sont envisageables. Seule la configuration de monoclonalité est souhaitée car elle seule, est source de données de séquençage. Les autres configurations généreront des données qui seront filtrées lors de la primo-analyse par la « Torrent suite ».
L’amorce ePCR-A couplée à la biotine permettra l’enrichissement ultérieure par un système de capture sur billes liées à la streptavidine.
Séquençage
En amont de l’étape de séquençage, une initialisation du PGM est requise et permet notamment une homogénéisation des valeurs de pH ~ 7,8 au sein des différents réactifs de l’appareil (« Auto pH« ).
La matrice de séquençage couplée aux amorces de séquençage et à la polymérase est chargée sur la puce Ion Torrent selon un protocole bien spécifique. Les puces se déclinent selon 3 capacités de séquençage ( Chip 314 >10Mb, Chip 316 >100Mb, Chip 318 >1Gb). A noter qu’une version « v2 » pour chacune des puces précitées existe et est indispensable pour toute application de séquençage nécessitant la chimie 400. Le séquençage multiparallélisé revient donc au décryptage simultané des fragments ADN couplés aux ISP. A chaque polymérisation de nucléotides non modifiés, la libération d’ ions H+ entraine une variation de pH, elle même détectée au niveau de la couche mince (technologie des semi-conducteurs) située au fond de chaque puits. L’ensemble des données brutes générées est transcrits sous forme de ionogrammes.
Données de séquençage
A l’issue du « run » de séquençage, le fichier .DAT regroupe l’ensemble des données brutes (ionogrammes). Ces fichiers sont transférés du PGM vers le Torrent Server. L’algorithme de « base calling » permet la conversion des données sous forme de lettres en séquences (A,T,C,G) formant le read (séquence au format fasta) associé à un score de qualité (Phred Score codé en ASCII), les deux types de données étant associés dans un fichier .FASTQ (qui tend à devenir le format de référence).
Un prétraitement est également appliqué sur la base des reads générés et qui équivaut au nombre d’ISPs vivantes ou « Live ISPs » (On parle d’ISPs vivantes pour les ISPs associées à la clef):
– trimming : élimination des adaptateurs et/ou portions de reads de mauvaise qualité
– filtres : élimination des « reads » de petites tailles, de mauvaise qualité, des polyclonaux
L’ensemble de ces informations est repris au travers du « report » généré à l’issue du séquençage et du prétraitement. Y sont également renseignés, le nombre de reads générés ainsi que leur taille moyenne.
Le terme « Nouvelle génération de séquençage à haut-débit » ( ou « Next generation sequencing » ) regroupe l’ensemble des technologies ou plateformes de séquençage développées depuis 2005 par quelques sociétés de biotechnologies.
L’objectif de cet article est de proposer de manière synthétique, un tour d’horizon des différents principes et caractéristiques de ces nouveaux outils et ainsi fournir quelques orientations et solutions techniques en réponses à des questions biologiques.
La position actuelle dans laquelle nous nous trouvons, entre la commercialisation de certains séquenceurs et ceux en cours de développement, est caractéristique d’une période charnière dissociant les technologies à haut débit dites de 2ème génération qui requièrent une étape d’amplification des molécules d’ADN en amont du décodage, de celles dites de 3ème génération permettant le décryptage direct d’une seule molécule d’ADN. Cette dernière catégorie fera à elle seule l’objet d’un prochain article.
Le marché des séquenceurs de 2éme génération est couvert par 3 grand groupes que sont Roche, Illumina et Life Technologies ayant respectivement proposés de manière successive, leur première plateforme à savoir le 454, le Genome Analyser et enfin le SOLiD. Depuis, le marché s’est étoffé proposant un panel de technologies au principe et caractéristiques propres telles qu’elles sont mentionnées ci dessous. A noter que parmi ce panel, le PGM, Ion torrent est le seul a connaitre une évolution constante en terme de capacités de séquençage (10Mb – reads de 100b – Juin 2011 / 100Mb – reads de 100b – Sept 2011 / 100Mb – reads 200b – Nov 2011 / 1Gb – Jan 2012 )
Chaque plateforme possède ses avantages et inconvénients et nombreuses sont celles configurées pour répondre à de nombreuses approches « omics », dans certaines limites. Il s’agira de faire un choix technologique selon les champs d’applications souhaités.
De manière générale, le type d’organisme étudié prédéterminera la technologie à employer. La notion de profondeur est récurrente à chaque application et dans l’objectif d’un reséquençage, le choix de la plateforme peut être identifié, de manière simplifiée, sur la base d’un calcul rapide ( P = N / L où P: Profondeur, N: Nombre des nucléotides totaux des reads, L: Taille du génome étudié).
Concernant les séquenceurs de 2ème génération, le séquençage de novo est une application mentionnée chez de nombreux fournisseurs (cf le tableau ci-dessous). Toutefois, l’association de deux technologies générant à la fois des reads longs (type 454, Roche) et une profondeur conséquente (type GAIIx, Illumina) palliant aux problèmes liés aux homopolymères et erreurs de séquençage, est préconisée (Au cours de l’article à venir sur les séquenceurs de 3ème génération, nous aborderons les plateformes davantage configurées pour cette application).
Ce paramètre de profondeur sera également à prendre en considération pour les champs d’applications incluant la notion d’analyse quantitative (RNAseq, ChIPseq, …). Si la profondeur permet d’atténuer les erreurs de séquençage, il reste néanmoins préférable de s’orienter vers des technologies à Q30 minimum (1 erreur sur 1000) pour la détection de SNPs.
Selon les technologies évoquées ci-dessus, les caractéristiques et champs d’applications ont évolués. Aussi, je vous propose de retrouver l’ensemble de ces informations actualisées en cliquant sur ce lien.
L’ensemble des informations sont détaillées dans l’article mentionné ci-dessous:
Qui sommes nous?
Christophe Audebert [@]
En charge de la plateforme génomique
du département recherche et développement
de la société Gènes Diffusion .
Renaud Blervaque [@]
Biologiste moléculaire, chargé d'études génomiques.
Gaël Even [@]
Responsable bioinformatique au sein
du département recherche et développement de la société Gènes Diffusion.
