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DNA_quality

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Bien évidemment cette infographie vue d’ici vous parait assez peu lisible. Après avoir cliqué dessus, vous pourrez vous apercevoir qu’elle permet de s’y retrouver dans la jungle de ces molécules aux noms tous plus baroques… Classe of antibio-original

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Un article du Sydney Morning Herald du 20 novembre 2016 réalise un assez bon plan de communication pour la société Microba.

L’objet : les tribulations gastro-dentaires d’un testeur du service que souhaite bientôt proposer la société investissant le marché de la métagénomique personnelle… Dans la roue des sociétés proposant des services de génomique personnelle voire de génomique récréative, voici venir celles proposant d’appliquer le séquençage haut-débit couplé à de l’analyse automatisée de séquences pour révéler une part de ce qui constitue votre microflore corporelle. Presque triviales, ces analyses métagénomiques sont aujourd’hui à la portée de qui peut les payer. Vous qui ne savez qu’offrir à Noël… peut être une piste de cadeau ! La question que l’on peut légitimement se poser est : à quelles fins analyser votre flore intestinale…? revenons sur l’article du Sydney Morning Herald pour tenter d’y trouver un intérêt ou deux.

microba

L’article commence sur un mode enthousiaste, la technologie permet de révéler une part de notre microbiote… à quoi bon s’en priver ? Le gonzo-journaliste rédacteur de l’article se propose comme cobaye et reçoit des « cotons tiges » de prélèvements qui lui permettent de procéder à l’envoi d’échantillons censés être des prélèvements de sa microflore corporelle -buccale et intestinale. Pas simple l’échantillonnage de la flore intestinale avec un coton tige ! Ainsi que le dit Dr Alena Rinke, porte-parole de Microba : « la recherche dans ce domaine vient d’exploser au cours des cinq ou dix dernières années. Nous constatons qu’il existe un nombre incroyable de liens entre les microbes de notre corps et des états pathologiques« . Ces « liens » peuvent être très divers : diabète, cancer du côlon, maladie inflammatoire de l’intestin, mélanome, polyarthrite rhumatoïde. En guise de commentaire, disons que tout comme corrélation n’est pas raison, liaison n’est pas causalité non plus. L’argument santé finit de motiver  le jeune investigateur de sa flore intérieure. Donc le journaliste expédie ses cotons tiges à la société australienne qui réalise une métagénomique ciblée (séquençage haut-débit d’une portion du gène de l’ARN 16S).

microba_connecting you to your microbes

Six semaines plus tard, ses résultats lui parviennent. Bilan : beaucoup de Ruminococcus, Blautia, Prevotella copri. Le petit bestiaire personnel qu’il héberge le fascine. Le test de Microba tente de mettre une couche d’interprétation de ces données de séquences mais le rendu semble un peu insatisfaisant pour le jeune intrépide. Il demande au professeur Andrew Holmes (plutôt sceptique sur l’intérêt du service) d’examiner rapidement ses résultats. La première métrique clé qui lui saute aux yeux est le nombre de Proteobacteria présente, dit – il. » En général, une personne en bonne santé a une faible proportion de bactéries dites « pro-inflammatoires ». Il faudrait pour Proteobacteria être inférieur à 5 %, et idéalement moins de 2 %. »

Le journaliste se voit rassuré avec une proportion de Proteobacteria, inférieure à 1 %.

Son microbiote est légèrement plus diversifié que la moyenne – c’est un bon point. Cela signifie qu’il est en bonne santé avec/grâce à un régime alimentaire équilibré et lui-même diversifié. Dans l’ensemble, le test de Microba conclut que sa flore intestinale suggère qu’il est en «excellente» santé avec un IMC de 20,7. Basé sur l’information de son microbiote, le test prédit qu’il a 28 ans (plutôt pas mal puisqu’il en accuse 26, avec un IMC de 21,9).

L’enthousiasme retombe un peu quand le cobaye-journaliste promoteur du service de Microba apprend qu’il a des proportions de Dialister en quantités supérieures à la moyenne. Dialister est un bon prédicteur de la gingivite. Il va donc se programmer une visite chez le dentiste ce qui fait toujours plaisir !

Comme l’a fait remarquer le professeur Holmes, les résultats reçu par le journaliste comporte beaucoup de données intéressantes – mais pas beaucoup d’idées utiles. A l’instar de ce que l’on a pu constater pour d’autres fournisseurs de « génomique personnelle », chaque échantillon reçu par Microba permet d’améliorer sa méthode de prédiction d’éléments interprétés du microbiote. Le service sera lancé au public au début d’année 2017.Afficher l'image d'origine

Moralité : à moins d’avoir un Holmes sous la main, ces sociétés devront fournir à leurs clients des résultats automatiquement pré-interprétés pour que ces derniers puissent avoir un outil influençant leur mode de vie ou leur gestion de planning-dentiste. En effet, l’inventaire à la Prévert de ce que l’on a dans le ventre n’a que peu de sens et nécessiterait d’être remis en perspective. Cette liste, ces métriques devraient être rattachées à la singularité du client du service pour réellement pouvoir lui être utiles. Un modèle prédictif basé sur une méthode d’apprentissage automatique ne peut suffire ! On comprend que plus Microba va séquencer, plus précis sera son modèle mais son développement futur passera par une meilleure intégration d’un résultat interprétable par le commun des mortels.

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bioscaling

En cliquant sur l’image ci-dessus, vous pourrez vous apercevoir qu’un ribosome fait la même taille qu’un rhinovirus… une infographie très simple mais efficace pour relativiser les « tailles du vivant »

http://learn.genetics.utah.edu/content/cells/scale/

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Le premier MOOC, en français, ambitieux, pour tous les botaniques en herbe… du néophyte au plus confirmé. Ce MOOC s’est ouvert le lundi 05 septembre 2016, dans cette première session (il y en aura d’autres), pour une durée de 7 semaines. Des semaines durant lesquelles vous pourrez collectionner des badges synonymes de votre épanouissement culturelle au sujet des plantes. Vous pouvez accéder directement au MOOC de Tela Botanica en cliquant sur la capture d’écran ci-dessous.

MOOC_tela_botanica

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Afficher l'image d'origineUne femme américaine devient « biologiquement » plus jeune après le suivi d’une thérapie génique que sa propre société a développé. Où quand Dorian Gray fait du commerce sans nuance (attention ! jeu de mots) en mode transhumanisme 2.0.

Elizabeth Parrish,  directrice générale de Bioviva USA Inc., est devenue, à grand renfort de communication, le premier être humain « à rajeunir » grâce à la thérapie génique développée par cette même entreprise. Cette dernière, sur la page d’accueil de son site internet, promet de démocratiser, dans un avenir proche, la thérapie génique et cellulaire. Dans un environnement convivial et confortable, les médecins de la société sont là pour corriger, avec précision, votre patrimoine corporel en voie de décrépitude.

L’un des premiers développements de la société, trouve une application dans la lutte contre le vieillissement, ce qui constitue toujours un excellent business plan compte tenu d’une corrélation établie entre âge et solvabilité. Ce philtre de jeunesse cible les télomères dont la taille serait proportionnelle à notre délai de péremption. De par leur structure particulière, les télomères requièrent d’être maintenus par une transcriptase inverse cellulaire spécifique appelée télomérase. En absence ou dans le cas de défaillance de télomérase, les télomères raccourcissent progressivement, jusqu’à atteindre une taille critique qui entraîne un arrêt des divisions cellulaires caractérisant la sénescence réplicative. Ainsi, les télomères forment une structure essentielle dans le contrôle de la viabilité cellulaire. Ceux-ci permettent de maintenir l’équilibre entre le vieillissement cellulaire et le risque de prolifération cellulaire incontrôlée.

Le score des télomères est calculé en fonction de la longueur des télomères des lymphocytes T. Ce résultat est basé sur la moyenne des longueurs des télomères des lymphocytes T  par rapport à celle de la population américaine de même classe d’âge. Plus le score est élevé plus les cellules concernées seront considérées comme « jeunes » et par extension, plus le patient sera lui-même considéré comme biologiquement jeune. En septembre 2015, Elizabeth Parrish âgée de 44 ans (un peu jeune notre candidate au rajeunissement) a reçu deux des thérapies géniques expérimentales de sa propre entreprise:

  • l’une pour la protéger contre la perte de la masse musculaire liée à l’âge
  • l’autre combattant cette diminution quantitative de cellules souches associée au vieillissement et à ses conséquences

Le test évoqué ici a été initialement conçu pour démontrer l’innocuité de la dernière génération des thérapies géniques et cellulaires. Si les premières données s’avèrent exactes et incontestables, il s’avère que ce test constituera une première mondiale: l’allongement des télomères dont le rognage était perçu comme inéluctable, irréversible. Dans le viseur de Bioviva, le  vieillissement réversible est donc en ligne de mire ou du moins les gérascophobes que le test aura rassuré voire convaincu.

Auparavant, la thérapie génique a été utilisée pour allonger les télomères des cellules murines cultivées, mais jamais sur un patient humain. En septembre 2015, les scores des télomères des globules blancs d’Elizabeth Parrish ont été collectés, par une clinique spécialisée au niveau des tests de laboratoire  (SpectraCell à Houston), immédiatement avant que les traitements ne lui furent administrés. Ces scores ont révélé que les télomères d’Elizabeth Parrish étaient inhabituellement courts pour son âge, la laissant précocement vulnérable aux maladies liées à l’âge. En mars 2016, les mêmes tests ont été effectués par SpectraCell. Ces derniers ont révélé que ses télomères avaient « allongé » d’environ 20 ans, passant de 6,71kb à 7,33kb: les globules blancs d’Elizabeth Parrish sont devenus biologiquement plus jeunes. Ces résultats ont été contrôlés de façon indépendante par les fondations: Bruxelles Heales (Healthy Company Life Extension), et la fondation britannique Biogerontology Research Foundation.

Elizabeth Parrish mais qui aimerait bien le devenir

Elizabeth Parrish mais qui aimerait bien le devenir

Elizabeth Parrish argumente: « actuellement, peu de thérapies offrent de réels avantages pour les personnes souffrant de maladies du vieillissement. La modification du mode de vie a un impact que limité pour le traitement de ces maladies. Les progrès de la biotechnologie apparaît être une meilleure solution, [avec ce test] nous avons fait l’histoire! ». Plusieurs signaux alimentent le scepticisme des membres de la communauté scientifique. Ainsi le fait qu’il n’y ait pas aujourd’hui de corrélation établie entre la longueur des télomères et la santé d’une personne. « C’est comme pour les cheveux gris, ce n’est pas parce qu’on se les teint qu’on vivra plus longtemps » commente Dana Glei, chercheuse à l’Université de Georgetown. Bioviva continuera de contrôler le sang de Parrish pendant les années à venir. Il reste à évaluer si le succès observé sur des leucocytes peut être étendu à d’autres tissus ou organes, est ce que ce teindre les cheveux ou rallonger ses télomères nous permet de perdre (ou gagner, cela dépend du point de vue) quelques années. Toutes ces interrogations pourraient avoir leurs réponses dans les cellules d’Elizabeth Parrish, le «patient zéro» de la thérapie génique réparatrice. Depuis ses premières injections de thérapie géniques, Bioviva a suscité un intérêt mondial,  le scepticisme de communauté scientifique, l’engouement des investisseurs et à fourni un cas d’école pour tout bon bioéthicien.

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Les cellules photovoltaïques ont un potentiel considérable pour satisfaire les besoins futurs en énergie renouvelable, cependant des méthodes efficaces et évolutives de stockage de l’électricité intermittente qu’elles produisent, sont aujourd’hui attendues pour la mise en œuvre, à grande échelle, de l’énergie solaire. Un stockage de cette énergie solaire pourrait passer par la case carburant. Le travail, présenté dans PNAS de février 2015 (Efficient solar-to-fuels production from a hybrid microbial–water-splitting catalyst system), rapporte le développement d’un système bioélectrochimique évolutif, intégré dans lequel la bactérie Ralstonia eutropha est utilisée pour convertir efficacement le CO2, avec l’hydrogène et l’oxygène produits à partir de dissociation de l’eau, en biomasse et alcools (cf. schéma ci-contre). Les systèmes photosynthétiques artificiels peuvent stocker l’énergie solaire et réduire chimiquement le CO2. Le système de fractionnement-biosynthétique hybride est basé sur un système de catalyseur inorganique, relativement abondant sur Terre (nécessairement sinon écologiquement ce ne serait pas terrible, avouons le…), biocompatible pour séparer l’eau en hydrogène et oxygène à des tensions basses. Lorsqu’elle est cultivée en contact avec ces catalyseurs, Ralstonia eutropha consomme le H2 produit pour synthétiser de la biomasse et des carburants voire d’autres produits chimiques, à partir de faible concentration de CO2 – sous entendu à des concentrations voisines de celles présentes dans l’air. Ce système évolutif a une efficacité énergétique de réduction de CO2 d’ ~ 50% lors de la production de la biomasse bactérienne et d’alcools. Ce dispositif hybride couplé à des systèmes photovoltaïques existants donnerait une efficacité énergétique de réduction des émissions de CO2 d’environ 10%, supérieure à celle des systèmes photosynthétiques naturels ! Nous en conviendrons la bactérie utilisée ici est génétiquement modifiée afin d’orienter son métabolisme vers une voie anabolique d’intérêt.

Ces travaux ouvrent la voie vers la « photosynthèse de synthèse ». Dans cette configuration intégrée, les rendements du solaire à la biomasse vont jusqu’à 3,2% du maximum thermodynamique pour dépasser celle de la plupart des plantes terrestres. En outre, l’ingénierie de R. eutropha a permis la production d’isopropanol jusqu’à 216 mg/L, le plus haut rendement jamais rapporté (> 300 %). Ce travail démontre que les catalyseurs d’origine biotique et abiotique peuvent être interfacés, intégrés… pour permettre à partir de l’énergie solaire, du CO2 et de quelques bactéries de développer des systèmes efficaces stockant une énergie intermittente sous forme de molécules organiques (le biomimétisme est la vraie tendance du moment).

Dans cette première version (celle du PNAS) l’électrode utilisée en nickel-molybdène-zinc s’est avérée toxique pour les bactéries qui voyaient leur ADN attaqué… dans cette version améliorée publiée dans Science (3 juin 2016)Afficher l'image d'origine, l’électrode toxique a été changée par une autre composée de cobalt-phosphore… Selon Daniel Nocera, le promoteur de l’étude : « Cela nous a permis d’abaisser la tension conduisant à une augmentation spectaculaire de l’efficacité. »

Nocera et ses collègues ont également été en mesure d’élargir la gamme de produits q’un tel système est capable de synthétiser pour y inclure l’isobutanol (un solvant) et l’isopentane (utilisé dans des boucle fermée pour actionner des turbines), ainsi que le PHB (un précurseur de bioplastiques). La conception chimique du nouveau catalyseur permet également une certaine « auto-régénération, » ce qui signifie que l’électrode ne sera pas lessivée au fur et à mesure de son activité.

 

En cancérologie, l’allogreffe de moelle osseuse s’inscrit dans un parcours thérapeutique notamment comme traitement de consolidation après une chimiothérapie. Aussitôt, les notions de rejet ou d’acceptation du greffon apparaissent et il devient indispensable que les systèmes HLA (Human Leucocyt Antigens, découvert en 1950) du donneur et du receveur soient les plus proches possibles.

Ce système immunogène, situé sur le bras court du chromosome 6 chez l’homme, est caractérisé par son polygénisme et son polymorphisme qui sont à l’origine d’une grande variabilité interindividuelle et en fait le déterminant principal du résultat de greffe. L’ensemble des gènes HLA sont subdivisés en trois régions du chromosome 6 qui contiennent chacune de nombreux gènes avec ou sans fonction immunologique. On distingue ainsi la région CMH de classe I, de classe II, et de classe III.

A ce jour, un rendu de typage est ciblé sur une portion génomique restreinte codant pour le HLA. Il s’agit de l’exon 2 et 3 des loci HLA-A, HLA-B et HLA-C (région I), l’exon 2 et 3 des loci HLA-DQ (DQ-A et DQ-B) et l’exon 2 pour HLA-DR (DRA et DRB1), où repose prés de 70% du polymorphisme. La région III ne renfermant pas de gènes intervenant dans la présentation antigénique.

 

C’est ainsi que différentes approches de typages ont été développées et l’avènement de la technique de PCR au milieu des années 1980 a pallié aux limites de résolution de la sérologie employée jusqu’alors. D’un typage rendu au niveau générique (2 Digits), la « PCR-SSO » (Sequence Specific Oligonucleotide) et la « PCR-SSP » (Sequence Specific Primer) développées dans les années 1990 ont permis d’accéder à un résultat allélique (4 Digits). Cette avancée technologique s’est poursuivie la décennie suivante avec la « PCR-SBT » (Sequence Based Typing) ou séquençage « Sanger » puis plus récemment avec la PCR en temps réel (ex: linkage). Toutes ces techniques de biologie moléculaire ont permis de mettre en avant le polymorphisme et la grande diversité génétique du HLA. Chaque année, de nombreux allèles sont découverts, alimentant continuellement la banque de données de référence IMGT.

Associé à cette augmentation constante du nombre d’allèles typés, le nombre d’ambigüités croît et met progressivement en difficulté les technologies conventionnelles qui atteignent leurs limites. De plus, le pourcentage de réussite des allogreffes n’atteint environ que 50%. L’exploitation du reste de l’information génomique permettrait potentiellement d’améliorer cette performance par un typage plus affiné.

Le recours au séquençage nouvelle génération apparait donc inévitable. En plus de gérer les ambiguïtés par un séquençage allélique,  le NGS permet de traiter simultanément de grandes quantités d’échantillons réduisant ainsi le coût unitaire, d’accéder à un niveau de résolution supérieur (4,6 ou 8 digits) tout en ayant la capacité de cibler des loci entier (Long Range PCR).

 

Ainsi, plusieurs stratégies existent avec leur solution technique adaptée à la préparation de la matrice d’ADN à séquencer:

– L’amplification ciblée des régions d’intérêt par PCR de fusion. Cette approche permets un gain de temps et une réduction des coûts en s’affranchissant des étapes de fragmentation, ligation, et autres purifications… .Par ailleurs elle n’est pas la mieux adapté dans le cas d’une couverture de séquençage de l’ensemble de la région génomique HLA.

– L’amplification par « Long Range PCR » permet une couverture complète des différents loci étudiés. Les fragments de plusieurs Kb subissent alors une fragmentation, une ligation des adaptateurs et indexation. Cette approche permet d’accéder à davantage d’informations (régions exoniques et introniques).

– La capture de séquences par hybridation. Même si cette solution est bien caractérisée elle n’est pas si efficace  en terme de capture avec une disparité selon la taille des fragments.

– Le séquençage de génome entier ou d’exome. Cette approche est la moins biaisée et couvre tous les gènes du système HLA. Paradoxalement, l’analyse nécessite beaucoup trop de ressources pour une utilisation en routine et ne permets  pas de traiter autant d’échantillons simultanément.

Plusieurs sociétés commerciales proposent des solutions clé en main depuis la préparation des échantillons (avec l’option « Long Range PCR » qui semble la plus plébiscité) jusqu’à l’analyse de résultats via leur logiciel dédié. Certaines sont en cours  de validation de méthode pendant que d’autres tentent d’inonder le marché. Parmi elles, Gendx, Omixon, Illumina, One lambda, Life technologies, Immucor, etc…

 

L’exploitation des capacités et caractéristiques des solutions de séquençage à haut-débit permettrait d’affiner considérablement le typage HLA. Ainsi le décryptage de l’ensemble des régions codantes et non-codantes du génome d’intérêt représente un enjeu important dans la réussite des greffes. Par ailleurs, cette approche nécessitera une mise à jour considérable des banques de données (IMGT) avec une validation de nombreux nouveaux allèles.

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Au cours des dix dernières années, la génomique connait une avancée technologique indéniable au travers des différents procédés de séquençage à haut-débit de deuxième génération. Néanmoins, certaines limites techniques subsistent, notamment par rapport à la quantité d’ADN requit, impliquant donc son extraction à partir de plusieurs millions de cellules. Cette contrainte implique une dilution de l’information pour des cellules aux fonctions biologiques bien souvent hétérogènes jusqu’au sein d’un même tissu.

En attendant la démocratisation du séquençage de troisième génération (Séquençage ADN sans amplification clonale) aux caractéristiques techniques qui permettraient un virage vers la génomique à l’échelle de la cellule unique , des méthodes alternatives appliquées à la seconde génération se développent afin d’accéder à cette hétérogénéité cellulaire. Ces solutions s’accompagnent donc, en amont du séquençage, d’une inévitable amplification de l’ADN de la cellule, préalablement isolée soit microdissection laser, système de microfluidique (ex: C1 Fluidigm), cytométrie en flux, ou encore micropipettage.

Ce poste est donc l’occasion de présenter la méthode d’amplification MALBAC, pour Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles (Science, Zong et al.).

La méthode MALBAC repose sur l’utilisation de primers spécifiques (séquence de 8 nucléotides variables s’hybridant aléatoirement sur l’échantillon, couplée à une séquence connue de 26 nucléotides) générant des amplicons aux extrémités complémentaires. Cette particularité favorise la formation d’une boucle, évitant ainsi aux brins néo-synthétisés de servir à nouveau de matrice à la PCR et d’engendrer un biais d’ amplification (contrairement à la MDA). Ces étapes d’amplifications quasi-linéaires sont répétées cinq fois, puis les amplicons sont amplifiés par PCR exponentielle classique, en amont du séquençage.

 

MALBAC favorise une meilleure couverture de séquençage ainsi qu’une amplification plus uniforme (cf représentation ci-dessous) . De par ses performances, elle surclasse les méthodes conventionnelles tel que PEP-PCR, DOP-PCR ou encore MDA, pour Multiple Displacement Amplification, méthode la plus répandue depuis dix ans. Jusqu’à 83% de couverture à 10X de profondeur contre 45% pour la MDA. Parmi les autres atouts, la quantité d’ADN initiale requise n’est que de 0.5pg (contre 1000pg pour la MDA) et la polymérase Bst associée connait un taux d’erreur de 1/10000 bases.

 

Les performances de cette méthode permettent ainsi  de reconsidérer les études génomiques ciblant un matériel biologique rare. Parmi elles, l’analyse de cellules tumorales circulantes, de tissus microdisséqués, de cellules embryonnaires, de micro-organismes, de cellules foetales circulantes, , etc…

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