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Ce billet très court, pour faire l’annonce (un peu tardive) du début d’un MOOC. Ce dernier s’annonce excellent, traitant du séquençage de génomes complets bactériens.

Université technique du Danemark (DTU)

Ce cours estival est proposé par l’excellente Université Technique du Danemark (DTU)

En voici le plan :Résultat de recherche d'images pour "whole genome sequencing coursera"

WEEK 1
Module 1
Welcome and introduction to typing of bacteria and use of Whole genome sequencing applied to surveillance of bacterial pathogens and antimicrobial resistance
3 vidéos

WEEK 2
Module 2
Introduction to Next Generation sequencing
3 vidéos

WEEK 3
Module 3
Whole genome sequencing tools- demonstration of analysis tools for species identification, MLST typing and finding resistance genes
3 vidéos

WEEK 4
Module 4
Whole genome sequencing tools- demonstration of analysis tools for Serotyping of Salmonella and Escherichia coli strains , and finding plasmid replicons
3 vidéos

WEEK 5
Module 5
Whole genome sequencing tools- demonstration of analysis tools for multiple analyzes, phylogenetic tree building and finding genetic markers from self-made databases and Summative Tutorial exercise
5 vidéos, 1 lecture
Noté: Tutorial final Quiz

 

Un article du Sydney Morning Herald du 20 novembre 2016 réalise un assez bon plan de communication pour la société Microba.

L’objet : les tribulations gastro-dentaires d’un testeur du service que souhaite bientôt proposer la société investissant le marché de la métagénomique personnelle… Dans la roue des sociétés proposant des services de génomique personnelle voire de génomique récréative, voici venir celles proposant d’appliquer le séquençage haut-débit couplé à de l’analyse automatisée de séquences pour révéler une part de ce qui constitue votre microflore corporelle. Presque triviales, ces analyses métagénomiques sont aujourd’hui à la portée de qui peut les payer. Vous qui ne savez qu’offrir à Noël… peut être une piste de cadeau ! La question que l’on peut légitimement se poser est : à quelles fins analyser votre flore intestinale…? revenons sur l’article du Sydney Morning Herald pour tenter d’y trouver un intérêt ou deux.

microba

L’article commence sur un mode enthousiaste, la technologie permet de révéler une part de notre microbiote… à quoi bon s’en priver ? Le gonzo-journaliste rédacteur de l’article se propose comme cobaye et reçoit des « cotons tiges » de prélèvements qui lui permettent de procéder à l’envoi d’échantillons censés être des prélèvements de sa microflore corporelle -buccale et intestinale. Pas simple l’échantillonnage de la flore intestinale avec un coton tige ! Ainsi que le dit Dr Alena Rinke, porte-parole de Microba : « la recherche dans ce domaine vient d’exploser au cours des cinq ou dix dernières années. Nous constatons qu’il existe un nombre incroyable de liens entre les microbes de notre corps et des états pathologiques« . Ces « liens » peuvent être très divers : diabète, cancer du côlon, maladie inflammatoire de l’intestin, mélanome, polyarthrite rhumatoïde. En guise de commentaire, disons que tout comme corrélation n’est pas raison, liaison n’est pas causalité non plus. L’argument santé finit de motiver  le jeune investigateur de sa flore intérieure. Donc le journaliste expédie ses cotons tiges à la société australienne qui réalise une métagénomique ciblée (séquençage haut-débit d’une portion du gène de l’ARN 16S).

microba_connecting you to your microbes

Six semaines plus tard, ses résultats lui parviennent. Bilan : beaucoup de Ruminococcus, Blautia, Prevotella copri. Le petit bestiaire personnel qu’il héberge le fascine. Le test de Microba tente de mettre une couche d’interprétation de ces données de séquences mais le rendu semble un peu insatisfaisant pour le jeune intrépide. Il demande au professeur Andrew Holmes (plutôt sceptique sur l’intérêt du service) d’examiner rapidement ses résultats. La première métrique clé qui lui saute aux yeux est le nombre de Proteobacteria présente, dit – il. » En général, une personne en bonne santé a une faible proportion de bactéries dites « pro-inflammatoires ». Il faudrait pour Proteobacteria être inférieur à 5 %, et idéalement moins de 2 %. »

Le journaliste se voit rassuré avec une proportion de Proteobacteria, inférieure à 1 %.

Son microbiote est légèrement plus diversifié que la moyenne – c’est un bon point. Cela signifie qu’il est en bonne santé avec/grâce à un régime alimentaire équilibré et lui-même diversifié. Dans l’ensemble, le test de Microba conclut que sa flore intestinale suggère qu’il est en «excellente» santé avec un IMC de 20,7. Basé sur l’information de son microbiote, le test prédit qu’il a 28 ans (plutôt pas mal puisqu’il en accuse 26, avec un IMC de 21,9).

L’enthousiasme retombe un peu quand le cobaye-journaliste promoteur du service de Microba apprend qu’il a des proportions de Dialister en quantités supérieures à la moyenne. Dialister est un bon prédicteur de la gingivite. Il va donc se programmer une visite chez le dentiste ce qui fait toujours plaisir !

Comme l’a fait remarquer le professeur Holmes, les résultats reçu par le journaliste comporte beaucoup de données intéressantes – mais pas beaucoup d’idées utiles. A l’instar de ce que l’on a pu constater pour d’autres fournisseurs de « génomique personnelle », chaque échantillon reçu par Microba permet d’améliorer sa méthode de prédiction d’éléments interprétés du microbiote. Le service sera lancé au public au début d’année 2017.Afficher l'image d'origine

Moralité : à moins d’avoir un Holmes sous la main, ces sociétés devront fournir à leurs clients des résultats automatiquement pré-interprétés pour que ces derniers puissent avoir un outil influençant leur mode de vie ou leur gestion de planning-dentiste. En effet, l’inventaire à la Prévert de ce que l’on a dans le ventre n’a que peu de sens et nécessiterait d’être remis en perspective. Cette liste, ces métriques devraient être rattachées à la singularité du client du service pour réellement pouvoir lui être utiles. Un modèle prédictif basé sur une méthode d’apprentissage automatique ne peut suffire ! On comprend que plus Microba va séquencer, plus précis sera son modèle mais son développement futur passera par une meilleure intégration d’un résultat interprétable par le commun des mortels.

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Afficher l'image d'origineSi vous vous intéressez au séquençage haut-débit, que vous souhaitez avoir un panorama des diverses technologies à disposition et que vous êtes friands de schémas de principe: la publication de Sara Goodwin, John D. McPherson & W. Richard McCombie.  Cet article publié dans la revue Nature de mai 2016 promet de faire un retour en arrière sur 10 ans d’évolution du séquençage haut-débit. Elle parvient à tenir ses promesses et livre effectivement des schémas (avec la charte graphique « Nature ») très bien faits, très pédagogiques ! En outre, le tableau (Table 1 | Summary of NGS platforms) permet à tous les pourvoyeurs de projets nécessitant le recours à du séquençage, d’avoir un pense bête sous la main pour associer la bonne technologie à la question biologique qui leur incombe… Et comme vous êtes pressés, vous pourrez retrouver l’intégralité de cet article en vous promenant et cliquant sur l’image ci-dessous.

Sara_Goowdin et al

 

Il s’agit d’une application rendue possible grâce à Google Map et hébergée sur un blog du Pallen Research Group. Cette application permet de connaître (en partie, car il s’agit d’un recensement sur déclaration volontaire des utilisateurs) des lieux où sont implantées les différentes technologies de séquençage haut-débit.

cartographie des plateformes de séquençage haut-débit
cartographie des plateformes de séquençage haut-débit

Historique schématique du séquençage d’acide nucléique

Un bref historique des évolutions du séquençage de l’ADN permet de comprendre ce que certains nomment révolution technologique… certainement concernant l’univers de la biologie moléculaire une innovation comparable à celle la PCR.

 

Allan Maxam , Walter Gilbert (USA) et Frederick Sanger (Royaume-Uni), les pionniers de la conquête de la séquence, ont mis au point deux méthodes très différentes permettant d’accéder à la lecture de la séquence. Maxam, Gilbert ont exploité des stratégies de dégradation chimique sélective quand Sanger choisit une stratégie de synthèse enzymatique sélective. Pour ces découvertes, Gilbert et Sanger ont été récompensés par le prix Nobel de chimie en 1980. L’histoire ne retient effectivement que Sanger, à juste titre, puisque cette stratégie bénéficiant de l’invention de laPCR (invention de Kary Mullis publiée en 1986, lui aussi nobélisé par le prix de chimie en 1993) et du développement de l’électrophorèse capillaire, permettant de simplifier la partie séparative et analytique. C’est ainsi que des sociétés comme Perkin Elmer, Beckman Coulter et Applied Biosystem ont investi le marché sur le principe même du séquençage Sanger sans le révolutionner mais en permettant son automatisation et l’augmentation du nombre de réactions de séquences analysables par jour. Une fois amorti le coût des séquenceurs, le coût de revient d’une séquence n’a cessé de baisser permettant de banaliser l’accès à la séquence.

Bien que se montrant de plus en plus performant, des applications comme le séquençage complet de génomes eucaryotes supérieurs, les approches métagénomiques (nécessité de cloner), les études de modulation de transcrits (la méthode SAGE les permettait sur la base du séquençage Sanger, cette méthode est lourde et nécessite toujours une phase de clonage) ont connu des limites quasi infranchissables (méthodes nécessitant trop de temps et de capitaux). Prenons à titre d’exemple les projets de séquençage du génome humain. Ces projets auront nécessité plus de 10 ans de travail et de 300 millions de USD pour le projet privé de Celera et un peu moins de 3 milliards de USD pour le projet HUGO (HUman Genome Organisation), le match entre Craig Venter (fondateur de Celera avec le soutien de Perkin Elmer) et James Watson (premier directeur du NIH coordinateur du consortium international) se solde par un match nul entaché de polémiques avec les publications en 2001 des premières séquences du génome humain.

L’année 2005 a connu à grands bruits, l’arrivée de nouvelles méthodes de séquençage à haut débit. Ces méthodes de séquençage massif font appel aux techniques de clonage et d’amplification moléculaire, leur spécificité relevait de leur stratégie de lecture.

En effet, la société 454 (rachetée par Roche en 2007), utilise des méthodes de pyroséquençage (luminescence par libération de pyrophosphate) de fragments d’ADN isolés dans des micro-gouttes comme micro-réacteur de PCR isolés au sein d’une émulsion, la société Solexa (rachetée par Illumina en 2007), utilise des méthodes d’amplification sur support solide permettant l’incorporation de bases terminateurs de chaîne réversibles marqués par des fluorochromes. La société Agencourt  (rachetée par Applied Biosystem en 2006), a quant à elle basé son système de détection sur le principe de l’amplification par émulsion et hybridation-ligation chimique.

Depuis 2007, une certaine frénésie s’empare du monde de la biologie moléculaire, un très grand nombre de machines que l’on qualifie tour à tour de NGS (Next Generation Sequencing), HTS (High Throughput Sequencing), ou encore de manière plus appropriée sequençage multi-parallélisé se trouvent disponibles et évoluent vers le plus de profondeur, ou vers le moindre coût, rendant obsolètes les versions précédentes (la société Illumina à titre d’exemple depuis le rachat de Solexa a lancé un modèle de séquenceur tous les ans).

Cette révolution technologique est sortie des laboratoires pour attirer l’attention d’investisseurs et autres banquiers conscients qu’une ruée vers l’or accompagnant la ruée vers la séquence pouvait s’engager. Dans ce sens nous mettons à disposition un document datant de 2007 réalisé pour le compte de la Deutsche Bank (ce document très complet a été co-réalisé par nombre de consultants en biotechnologies, il permet de décortiquer assez finement les 3 technologies présentes sur le marché à partir de 2005 et de montrer les attentes des mondes scientifique et financier)

Afin de terminer ce bref tour d’horizon il semble nécessaire de hiérarchiser ces nouvelles technologies. Il est possible de distinguer tout d’abord deux grands groupes : les technologies sans amplification (permettant de séquencer une seule molécule d’adn matriciel, citons exemple de la technologie SMRT de Pacific Biosciences, la technologie tSMS de Helicos Biosciences ou encore celle toujours en développement mais très attendue développée par Oxford Nanopore) et avec amplification (toutes les technologies amplifiant une matrice clonale d’adn issu d’une librairie)

Parmi cette seconde classe, il est possible de distinguer trois grandes classes de matériel :

–       les usines à produire de la séquence (type Hiseq 2000 de Illumina permettant de séquencer jusqu’à 200 Gb par run de 8 jours

–       les séquenceur de paillasse (type PGM de IonTorrent de taille et prix beaucoup plus modeste permettant de réaliser des run autour de 100 Mb avec une perspective de 1 Gb pour début 2012)

–       les séquenceurs haut débit en voie d’obsolescence (454 de Roche, les versions des séquenceurs Illumina antérieures au HiSeq 1000 etc.)

Cet historique est bien entendu un prétexte pour planter le décor et présenter les forces en présence. Après l’âge des pionniers (Maxam et Sanger), celui de la douce exploitation (séquenceur capillaire) vient celui de l’accélération que certains nomment révolution… ces technologies marquent quoi qu’il en soit un tournant pour la génomique et pour les applications actuelles et en devenir qui y sont liées. Enfin la diffusion de ces technologies va de paire avec un changement de physionomie des laboratoires : la biotechnologie est  une science composite où bio-informatique, biologie cellulaire et moléculaire mais aussi physique et statistique deviennent de plus en plus interdépendantes.

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