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Ce post fait naturellement suite à celui dédié à la seconde génération de séquenceurs multi-parallélisés, et conserve la même approche, à savoir un tour d’horizon des technologies et une évocations des informations générales sur le sujet.

A l’instar du PGM de Ion torrent mis sur le marché depuis un an (10Mb – reads 100b – 06.2011 / 100Mb – reads 200b -11.2011 / 1Gb – reads 400b – prévu début 2012), la seconde génération de séquenceurs haut débit tend vers une production de reads de plus en plus longs et de moins en moins chère. Toutefois, on est en droit de se demander quelle sera leur pérennité face à la 3éme génération répondant à un cahier des charges assez similaire et la possibilité de bénéficier de nouvelles applications.

 

Le principe de la 3ème génération peut être symbolisé par le séquençage d’une molécule d’ADN sans étape de pré-amplification (contrairement à la génération actuelle type 454 Roche, SOLiD Life technologie, Ion Proton, PGM Ion torrent, HiSeq Illumina, …) en conservant l’incorporation de nucléotides, par cycles ou non ( dans ce dernier cas, le terme de « Séquençage d’ADN simple molécule en temps réel » est approprié).

Les technologies « SMS » pour « Single Molecule Sequencing » peuvent être regroupées selon trois catégories:

– Technologies de séquençage en temps réel impliquant la synthèse du brin d’ADN complémentaire via une ADN polymérase.

– Technologies de séquençage par détection des bases successives d’une molécule d’ADN au travers de nanopores.

– Technologies de séquençage basées sur des techniques de microscopie.

En combinant les dernières avancées dans la nanofabrication, la chimie de surface et l’optique, Pacific Biosciences (Pacbio RS) a lancé une plateforme technologique puissante appelée technologie de molécule unique en temps réel, ou « SMRT » pour « Single Molecule Real-time sequencing ». Parmi ses concurrents directs, Helicos Biosciences (Helicos) qualifié  « tSMS » pour « True Single Molecule Sequencing ». Malgré le recours à une technologie analogue, la mention « Temps réel » auquel il échappe est simplement liée à une incorporation cyclique des nucléotides fluorescents.

D’autres technologies, à des degrés de développement plus ou moins avancé, sont dans les tuyaux et qui sait de Noblegen, Starlight, Cracker Bio, NABSys, Halcyon, ou autres…  révolutionnera encore un peu plus cet univers du haut débit et suivra le chemin emprunté dernièrement par Oxford Nanopore

 

 

Le séquenceur de paillasse PGM IonTorrent

Notre laboratoire possède un PGM IonTorrent de Life Technologies. Cet outil haut-débit est un séquenceur de paillasse permettant de réaliser des runs à prix relativement accessible, inférieur à 800€/run  (cf. notre historique du séquençage proposé dans un post précédent).

Nous avons pu réaliser, en avant-première, un séquençage complet d’une souche d’Escherichia coli sur une puce 316 ,qui permet d’obtenir 100Mb / run, soit l’équivalent d’un peu plus d’une couverture de 20X d’une Escherichia coli.

Pour plus d’informations sur ce séquençage, vous pouvez lire:

– le communiqué de presse associé : CP_Escherichia_coli

-L’article de Futura Sciences sur le sujet : http://www.futura-sciences.com/fr/news/t/genetique-1/d/sequencage-haut-debit-de-coli-vers-une-medecine-personnalisee_31316/

– Des articles plus généralistes sortis dans différents journaux :

www.20minutes.fr

partenairesante.arsnpdc.fr

Ou regarder ces reportages (datés du 06/07/2011) :

Reportage-LCI-séquençage-coli-06072011

Reportage-BFMTV-séquençage-coli-06072011

 

10 chips 314 = 1 chip 316

 

 

étape de préparation de la matrice enrichie

Le procédé de séquençage se déroule sur 3 jours :

– préparation de la librairie : 1 jour (fragmentation de l’ADN génomique…)

– préparation de la matrice : 1 jour (PCR en émulsion + enrichissement)

-séquençage de la matrice enrichie : 1/2 jour

c'est parti !

 

Et on obtient le report suivant : Report Run IonTorrent

(*) Sequencing data were generated using system software and protocols bothnon released and non supported by Ion TorrentTM (part of Life TechnologiesTM) and may not reflect actual Ion Torrent PGMTM performance in term of throughput and/or accuracy.

Historique schématique du séquençage d’acide nucléique

Un bref historique des évolutions du séquençage de l’ADN permet de comprendre ce que certains nomment révolution technologique… certainement concernant l’univers de la biologie moléculaire une innovation comparable à celle la PCR.

 

Allan Maxam , Walter Gilbert (USA) et Frederick Sanger (Royaume-Uni), les pionniers de la conquête de la séquence, ont mis au point deux méthodes très différentes permettant d’accéder à la lecture de la séquence. Maxam, Gilbert ont exploité des stratégies de dégradation chimique sélective quand Sanger choisit une stratégie de synthèse enzymatique sélective. Pour ces découvertes, Gilbert et Sanger ont été récompensés par le prix Nobel de chimie en 1980. L’histoire ne retient effectivement que Sanger, à juste titre, puisque cette stratégie bénéficiant de l’invention de laPCR (invention de Kary Mullis publiée en 1986, lui aussi nobélisé par le prix de chimie en 1993) et du développement de l’électrophorèse capillaire, permettant de simplifier la partie séparative et analytique. C’est ainsi que des sociétés comme Perkin Elmer, Beckman Coulter et Applied Biosystem ont investi le marché sur le principe même du séquençage Sanger sans le révolutionner mais en permettant son automatisation et l’augmentation du nombre de réactions de séquences analysables par jour. Une fois amorti le coût des séquenceurs, le coût de revient d’une séquence n’a cessé de baisser permettant de banaliser l’accès à la séquence.

Bien que se montrant de plus en plus performant, des applications comme le séquençage complet de génomes eucaryotes supérieurs, les approches métagénomiques (nécessité de cloner), les études de modulation de transcrits (la méthode SAGE les permettait sur la base du séquençage Sanger, cette méthode est lourde et nécessite toujours une phase de clonage) ont connu des limites quasi infranchissables (méthodes nécessitant trop de temps et de capitaux). Prenons à titre d’exemple les projets de séquençage du génome humain. Ces projets auront nécessité plus de 10 ans de travail et de 300 millions de USD pour le projet privé de Celera et un peu moins de 3 milliards de USD pour le projet HUGO (HUman Genome Organisation), le match entre Craig Venter (fondateur de Celera avec le soutien de Perkin Elmer) et James Watson (premier directeur du NIH coordinateur du consortium international) se solde par un match nul entaché de polémiques avec les publications en 2001 des premières séquences du génome humain.

L’année 2005 a connu à grands bruits, l’arrivée de nouvelles méthodes de séquençage à haut débit. Ces méthodes de séquençage massif font appel aux techniques de clonage et d’amplification moléculaire, leur spécificité relevait de leur stratégie de lecture.

En effet, la société 454 (rachetée par Roche en 2007), utilise des méthodes de pyroséquençage (luminescence par libération de pyrophosphate) de fragments d’ADN isolés dans des micro-gouttes comme micro-réacteur de PCR isolés au sein d’une émulsion, la société Solexa (rachetée par Illumina en 2007), utilise des méthodes d’amplification sur support solide permettant l’incorporation de bases terminateurs de chaîne réversibles marqués par des fluorochromes. La société Agencourt  (rachetée par Applied Biosystem en 2006), a quant à elle basé son système de détection sur le principe de l’amplification par émulsion et hybridation-ligation chimique.

Depuis 2007, une certaine frénésie s’empare du monde de la biologie moléculaire, un très grand nombre de machines que l’on qualifie tour à tour de NGS (Next Generation Sequencing), HTS (High Throughput Sequencing), ou encore de manière plus appropriée sequençage multi-parallélisé se trouvent disponibles et évoluent vers le plus de profondeur, ou vers le moindre coût, rendant obsolètes les versions précédentes (la société Illumina à titre d’exemple depuis le rachat de Solexa a lancé un modèle de séquenceur tous les ans).

Cette révolution technologique est sortie des laboratoires pour attirer l’attention d’investisseurs et autres banquiers conscients qu’une ruée vers l’or accompagnant la ruée vers la séquence pouvait s’engager. Dans ce sens nous mettons à disposition un document datant de 2007 réalisé pour le compte de la Deutsche Bank (ce document très complet a été co-réalisé par nombre de consultants en biotechnologies, il permet de décortiquer assez finement les 3 technologies présentes sur le marché à partir de 2005 et de montrer les attentes des mondes scientifique et financier)

Afin de terminer ce bref tour d’horizon il semble nécessaire de hiérarchiser ces nouvelles technologies. Il est possible de distinguer tout d’abord deux grands groupes : les technologies sans amplification (permettant de séquencer une seule molécule d’adn matriciel, citons exemple de la technologie SMRT de Pacific Biosciences, la technologie tSMS de Helicos Biosciences ou encore celle toujours en développement mais très attendue développée par Oxford Nanopore) et avec amplification (toutes les technologies amplifiant une matrice clonale d’adn issu d’une librairie)

Parmi cette seconde classe, il est possible de distinguer trois grandes classes de matériel :

–       les usines à produire de la séquence (type Hiseq 2000 de Illumina permettant de séquencer jusqu’à 200 Gb par run de 8 jours

–       les séquenceur de paillasse (type PGM de IonTorrent de taille et prix beaucoup plus modeste permettant de réaliser des run autour de 100 Mb avec une perspective de 1 Gb pour début 2012)

–       les séquenceurs haut débit en voie d’obsolescence (454 de Roche, les versions des séquenceurs Illumina antérieures au HiSeq 1000 etc.)

Cet historique est bien entendu un prétexte pour planter le décor et présenter les forces en présence. Après l’âge des pionniers (Maxam et Sanger), celui de la douce exploitation (séquenceur capillaire) vient celui de l’accélération que certains nomment révolution… ces technologies marquent quoi qu’il en soit un tournant pour la génomique et pour les applications actuelles et en devenir qui y sont liées. Enfin la diffusion de ces technologies va de paire avec un changement de physionomie des laboratoires : la biotechnologie est  une science composite où bio-informatique, biologie cellulaire et moléculaire mais aussi physique et statistique deviennent de plus en plus interdépendantes.

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