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Graphical abstractQue feriez vous avec un séquenceur qui tient dans la paume de votre main… ? Alors qu’il y a quelques années était annoncée l’arrivée de troisième génération de séquenceur, toujours plus sensibles (permettant de séquencer l’ADN natif, non pré-amplifié comme cela peut être le cas dans les technologies de séquençage de 2ème génération), générant des reads toujours plus longs, entachés de beaucoup plus d’erreurs… C’est aujourd’hui, avec le séquençage Minion de Nanopore que se pose réellement la question du changement d’applications qu’induirait le fait de posséder ce type de technologies.

Cet article paru ce mois-ci dans la revue Médecine/Sciences, invite à réfléchir sur les conséquences de l’introduction de cette technologie en milieu hospitalier : Séquençage par nanopores – Perspectives d’applications en santé humaine essaie de faire le tour de la question.

 

MS_2018

Résultat de recherche d'images pour "qPCR design"

La qPCR est une méthode permettant de doser la quantité d’acides nucléiques ciblés introduits dans une réaction de PCR. Pour des raisons de rapidité, de sensibilité et de coût, souvent l’option de travailler avec un agent intercalant (sans sonde) est choisie. La bonne vieille qPCR SybGreen nécessitant le seul design d’une paire d’amorces…

Simple ? Pas nécessairement, car cette approche, certainement plus que la version qPCR Taqman nécessite un travail in silico et de validation/optimisation expérimentales comme passages obligés. C’est ce que montre la publication de Stephen Bustin et Jim Huggett dans Biomolecular Detection and Quantification. Cette publication incontournable pour les férus de qPCR SybrGreen est un beau travail pour lequel la publication vous est mise à disposition en cliquant ci-dessous. On attend ardemment une déclinaison Taqman, HRM, MolecularBeacon de ce type de revues permettant de formaliser des procédures visant à optimiser l’approche d’optimisation.

qPCR primer design revisited

 

La quantification par qPCR SybrGreen suppose une relation linéaire entre le logarithme de la quantité initiale introduite en PCR et la valeur Cq obtenue lors de l’amplification. Ceci permet de calculer l’efficacité d’amplification d’un test et de borner ses limites de détection et de quantification. Les caractéristiques d’un test qPCR (bien) optimisé sont les suivantes:

• Une excellentissime spécificité révélée par un pic unique lors de l’établissement de la courbe de fusion

• Une efficacité d’amplification élevée (95-105%)

• Une courbe étalon linéaire (R2 > 0,980)

• Une bonne répétabilité

• Peu ou prou de dimères d’amorces

Pour paraphraser la conclusion de l’article, afin de finir par convaincre de lire cet « essentiel » de la qPCR :

La conception, le design d’une PCR est souvent au cœur de tout projet de recherche visant à quantifier les acides nucléiques. Il doit être réalisé avec soin, mais peut être simplifié en suivant un flux de travail simple, comme décrit ci-dessus (cf. diagramme workflow design qPCR).

Cela signifie généralement une spécificité absolue, l’absence de structures en épingle à cheveux ou de potentielles dimérisations croisées. Une bonne conception des essais doit tenir compte de la structure de l’amplicon (paramètre souvent négligé) et veiller à ce que les cibles de l’amorce soient exempts de structure secondaire. Il existe de nombreuses opinions et lignes directrices; une recherche sur Internet pour les termes « qPCR Assay Design » renvoie 695.000 pages. Cependant, bon nombre de ceux-ci sont basés sur des mythes ou peuvent être appropriés pour la PCR mais nécessitent des modifications subtiles (ou moins subtiles) pour être utilisés pour développer une qPCR. Chaque « nouveau » dosage doit être correctement validé, la validation in silico servant de filtre initial pour éliminer des designs ne permettant pas d’aboutir à une bonne qPCR. L’optimisation et la validation empirique sont une partie essentielle, mais souvent négligée, de toute expérience qPCR. Cela s’applique aussi bien aux essais nouvellement conçus qu’aux essais obtenus en reprenant des amorces issues d’une publication, par exemple. Avec tant d’essais prêts à l’emploi, on peut se demander pourquoi quelqu’un voudrait se donner la peine de concevoir un autre essai. D’autant plus que l’on a l’impression que la conception de son propre test est beaucoup plus complexe et peu commode que de simplement l’acheter à un fournisseur commercial, qui en tout cas aura validé chacun de ses tests. Cette perception est erronée pour deux raisons:

1° il se peut que les amorces commerciales ou les conditions d’analyse n’aient pas été validées ou optimisées de façon expérimentale.

2° on ne peut pas présumer qu’un ensemble d’amorces produira les mêmes résultats dans des conditions expérimentales différentes puisque la performance du dosage peut varier selon les méthodes d’extraction utilisées pour purifier les acides nucléiques.

qPCR_workflow

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Résultat de recherche d'images pour "metasub"Voici une initiative originale conciliant deux tendances du moment : étude d’un microbiote & le concept de smart city. Saugrenu ? Science tendance ? Projet formaté pour la vulgarisation, la valorisation médiatique ? Quoi qu’il en soit, ce projet nous est plutôt bien vendu, à grand renfort d’infographies, de photographies, de vidéos un peu inquiétantes de personnes en train de réaliser des prélèvements de surface dans le métro. Derrière la communication, l’idée du projet est séduisante : utiliser des données biologiques, en l’occurrence des profils de l’ADNr 16S ou des séquençages génomes entiers définissant un microbiote pour améliorer nos écosystèmes urbains. Il est vrai qu’à une époque où l’on conçoit du mobilier urbain volontairement inconfortable pour ne pas que le passant puisse faire autre chose que passer, il ne semble pas intuitif d’aller chasser le microbiote pour concevoir une ville moins idiote. Même si la ville est le terrain de tous les paradoxes, il est captivant d’observer que cet environnement quotidien, banal, renferme une part de mystère… mystère qui serait à l’origine des odeurs du métro ? quelles espèces bactériennes propres à New York, Paris ou Rome sont à découvrir… quelle ville a le microbiote le plus diversifié ? quelle est celle qui aura le privilège d’héberger le plus de bactéries résistantes aux antibiotiques, la plus propre ou la plus sale ?

Résultat de recherche d'images pour "metagenomic subway"

 

En juillet 2017, Stockholm accueillera la 3ème conférence annuelle « Metagenomics and Metadesign of Subways and Urban Biomes (MetaSUB)« , qui rassemblera des chercheurs dédiés à la cartographie du métagénome urbain de plus de 67 villes à travers le monde (dont Paris et Marseille). Ce projet ambitieux a débuté il y a deux ans, alors que le professeur Christopher Mason et son équipe ont réalisé la première étude sur la microflore de surface, dressant le microbiome de la ville de New York. Avec ces données moléculaires essentiellement basées sur le séquençage haut-débit 16S, le projet a étudié la façon dont ce «microbiome urbain» change avec des variables telles que la météo, la propreté, les matériaux de construction et même les niveaux socio-économiques du quartier. L’équipe a cherché à établir des profils de microbiotes dans le métro, à identifier les bio-menaces potentielles et à fournir des données complémentaires qui peut être utilisé par la ville pour créer une «ville intelligente», c’est-à-dire qui agrège des données hétérogènes pour améliorer son urbanisme.

Près de la moitié (48%) de l’ADN séquencé ne correspondait pas aux organismes connus, soulignant qu’un microbiota incognita entoure les usagers du métro. Le projet du métro de New York n’était que le début, ce qui a conduit à la création d’un consortium international de laboratoires pour établir une « cartographie » mondiale de microbiomes dans les systèmes de transport en commun notamment.  En cliquant sur la capture d’écran ci-dessous, on pourra se faire une idée de la communication « Metasubienne » qui n’a rien à envier à celle de Tara Oceans ou de MetaHit (qui sont toutes trois, d’excellentes communications autour d’un projet et d’un consortium).

MetaSUB

Voici en quelques mots les promesses annoncées dans l’article Geospatial Resolution of Human and Bacterial Diversity with City-Scale Metagenomics (Cell Syst, 2016) :

« La région métropolitaine de New York City (NYC) est un endroit idéal pour entreprendre une étude métagénomique à grande échelle car c’est la plus grande et la plus dense des États-Unis; 8,2 millions de personnes vivent sur une masse continentale de seulement 755 km2. En outre, le métro de New York est le plus grand système de transport en commun dans le monde (par le nombre de stations), qui s’étend sur plus de 406 km et utilisé par 1,7 milliard de personnes par an. Ce vaste écosystème urbain est une ressource précieuse qui nécessite un suivi pour le maintenir et le sécuriser contre les actes de bioterrorisme, les perturbations environnementales ou les épidémies. Ainsi, nous avons cherché à caractériser le métagénome de NYC en examinant le matériel génétique des microorganismes et d’autres ADN présents dans, autour et au-dessous de New York, en mettant l’accent sur les métros et les zones publiques très empruntés. Nous envisageons cela comme une première étape vers l’identification des menaces biologiques potentielles, la protection de la santé des New-Yorkais et la mise à disposition de données moléculaires qui pourront être utilisée par la ville pour créer une «ville intelligente», c’est-à-dire celle qui utilise des données de grande dimension pour améliorer l’urbanisme, la gestion de l’environnement bâti, des transports en commun et de la santé humaine. »

Résultat de recherche d'images pour "fermenteur"L’objet de ce petit article est de mettre en lumière cette industrie qui se porte plutôt pas mal en France. Après un petit retard à l’allumage, en atteste les craintes formulées dans des articles de 2008- 2009, « Bioproduction en France, toujours un train de retard« , il s’agit d’un secteur en relative expansion. Quand on parle de bioproduction, de quoi parle t’on ? La bioproduction peut être définie comme la production des produits de santé d’origine biologique et biotechnologique. En clair, à partir de briques du vivants on formule un produit à allégation santé (anticorps monoclonaux, les protéines recombinantes comme l’insuline  ou encore les vaccins sont des outils indispensables au traitement de nombreuses pathologies), en substance la bioproduction pourrait être comparer voire parfois opposée à la pharmacochimie.

La carte obtenue par le LEEM –  le syndicat du milieu pharmaceutique qui s’est substitué en 2002 au Syndicat national de l’industrie pharmaceutique (SNIP)- fait apparaître un regroupement de l’activité autour de quatre bassins principaux :
– la région Rhône-Alpes
– la vallée de la Seine
– l’Alsace
– le département du Nord