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Résultat de recherche d'images pour "london calling nanopore"Le London Calling a été l’occasion pour Oxford Nanopore Technologies (ONT) de frimer un peu avec des annonces et une gamme de séquenceurs ciblant des marchés très différents. Cette technologie de rupture risque d’être un tsunami technologique pour finir par déferler dans nos vies, car avec un séquenceur qui tient dans la poche et se connecte à un smartphone, ce qui était hier science fiction devient réalité.

ONT a fourni, en ce début de mois de mai 2017, informations concernant les développements technologiques et les perspectives de commercialisation. L’une d’elles, concerne une nouvelle « flow cell » pour MinIon, appelée Flongle (Flow Cell Dongle) pour les applications de diagnostics cliniques. Le développement du Flongle aidera également le travail de l’entreprise sur SmidgION, un séquenceur miniature avec de petites flow cells alimentées par un téléphone mobile (voir la photo ci-dessous).

Clive Brown, responsable technologique d’ONT, a donc présenté diverses mises à jour lors du « London Calling 2017 », le grand barnum des utilisateurs de la technologie, en ce début de mois de mai. En ce qui concerne le séquenceur MinION, Brown a déclaré que la technologie est d’ores et déjà capable de délivrer plus de 20 Gb de données par run de 48 h. (Actuellement, les utilisateurs sont plus autour des 15 Gb, ce rendement plus limité serait partiellement lié à la préparation de la bibliothèque, en particulier la quantification appropriée de la taille et de la quantité d’ADN de départ, selon Brown).

En mars, la société avait parlé d’une nouvelle méthode de séquençage, appelée séquençage 1D2, où les deux brins d’une librairie bicaténaire sont poussés par nanopore séquentiellement sans être physiquement connectés. La méthode contourne un brevet détenu par Pacific Biosciences et aboutit à des lectures plus précises que la seule lecture 1D, où seul un brin de la librairie constituée est séquencé. ONT prévoit de publier le kit de séquençage 1D2 courant mois de mai 2017, ainsi qu’une nouvelle chimie appelée R9.5. Les kits 2D ne sont plus disponibles et l’entreprise vient juste d’interrompre les anciennes cellules R9.4.

Dans l’ensemble, la précision de lecture brute est maintenant supérieure à 90 % pour la chimie R9.4 et supérieure à 95 % pour la  R9.5 (en mode 1D2), ces deux chimies tournant à 450 bases / min.

prix_flow_cell

Ci-dessus, les prix actuels de la chimie 9.5. Là où l’on constate que le prix décroit drastiquement avec la quantité commandée… je pense qu’une mutualisation ou la création d’une centrale d’achats s’imposent ! Avec cette nouvelle chimie,ONT a diffusé une nouvelle version, la 1.6, de son logiciel MinKnow ainsi que de son basecaller Albacore (maintenant en 1.1). En outre, ONT a récemment commercialisé des kits de séquençage direct d’ARN et diffusé un pipeline pour réaliser le profil de résistance aux antibiotiques appelé ARMA (an analysis workflow for identification of antibiotic-resistant microorganisms in real time). À partir d’août, la société prévoit d’envoyer des flow cells à la température ambiante, des développements sont en cours pour allonger leur date limite d’exploitation (aujourd’hui une flow cell reçue doit être utilisée sous 8 semaines).  Toujours visant le marché de l’utra-portabilité, en visant la décentralisation de l’acte de séquençage, ONT développe également un petit module de calcul pour le basecalling qui ferait environ la moitié de la taille du séquenceur MinION et pouvant y être directement connecté. Sur ce volet de la portabilité, le dispositif de préparation d’échantillons, VolTrax (voir vidéo ci-dessous), d’Oxford Nanopore est maintenant entre les mains de plus de 50 utilisateurs qui ont récemment reçu leurs premiers kits. La société développe actuellement un kit à base de transposase rapide et un kit d’indexation 4-plex rapide.

voltrax

Les chercheurs de l’entreprise travaillent déjà sur une nouvelle version, VolTrax V2, qui devrait être disponible à la fin de 2017. Cette version permettra la PCR, la quantification des échantillons et le contrôle de la qualité des échantillons, tout en utilisant les mêmes aimants et appareils de chauffage que la version actuelle. Il sera également capable de gérer plus d’échantillons et d’exécuter des protocoles de préparation d’échantillons plus complexes. Il sera livré avec un chargeur de réactif avec des réactifs lyophilisés (lyophilisés, c’est mieux, parce que le séquenceur qui tient dans la main c’est bien, mais s’il vous faut un congélateur pour réaliser, sur le terrain, la moindre réaction…)

En mars, Oxford Nanopore a annoncé le lancement du GridIon X5, un séquenceur nanopore de bureau (et non plus de poche comme le MinION) pouvant permettre de travailler jusqu’à 5 flow cells à la fois et disposera d’un débit de 100 Gb par run de 48 heures. La plate-forme est livrée avec un cluster local de calcul haute performance qui permet le basecalling en temps réel ainsi que l’analyse des données. La première unité a été expédiée en début de semaine (en atteste la photo ci-dessous)

La société a récemment utilisé le GridIon pour séquencer un génome humain à 20 X, en utilisant 5 flow cells et la chimie R9.4 (en mode 1D).

Le GridION X5 permet d’exécuter simultanément ou individuellement jusqu’à cinq expériences; Les utilisateurs peuvent choisir d’utiliser tout ou partie de cette ressource à tout moment. La version actuelle de la chimie et du logiciel permet de générer jusqu’à 100 Gb de données pendant une exécution GridION X5 et le module de calcul peut analyser ces données en temps réel.

En utilisant la même technologie de base que le MinION et PromethION, le GridION X5 offre la possibilité de séquencer ADN et ARN en temps réel (dans la vidéo ci-dessous Clive Brown se transforme en Pipetman pour la promotion du GridION) :

GridION pricing

gridion

Oxford Nanopore devait envoyer il y a peu les premiers consommables pour PromethION permettant de délivrer 50 Gb et pourraient en générer jusqu’à 120 Gb /jour dans un futur proche. En vitesse de croisière cette configuration sera capable de générer plus de données que le NovaSeq d’Illumina. Du lourd, du gros et du très petit : de quoi satisfaire les plateformes de séquençages et bientôt certainement des utilisateurs non touchés actuellement par la technologie aujourd’hui, puisque la version ci-dessous permet de préparer une librairie et de la séquencer avec quelques breloques qui tiennent dans le creux d’une main !

La quête du read de 1 Mb : F1000Researchblog

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Photo du profil de Oxford Nanopore Technologies LtdLe 12 décembre 2016, Oxford Nanopore a annoncé avoir levé 126 Mega USD en s’appuyant largement sur un fond d’investissement chinois. La société, spécialisée dans le séquençage de 3ème génération est aujourd’hui valorisée à hauteur de 1,25 milliard de livres. Cette technologie qui s’est laissée désirer serait elle sur le point de révolutionner les applications du séquençage haut-débit ?

En effet, la promesse de décentralisation du séquençage portée par le MinION est séduisante (un séquenceur légèrement plus grand qu’une clé usb a permis de séquencer Ebola en Guinée). Evidemment, à grand renfort de communication dont nous nous faisons d’ailleurs souvent écho, Oxford Nanopore Technologies (ONT) entretient le désir pour créer une attente motivant les levées de fonds, ces mêmes fonds qui permettront de développer les forces de ventes nécessaires au déploiement de la technologie. ONT affiche d’ores et déjà une centaine de publications scientifiques. Pour répondre à l’épineuse question « est ce que ONT est une technologie de rupture (disruptive innovation)? », on fait appel au modèle de Clayton Christensen.model de christensen

Christensen a développé sa théorie en s’intéressant à plusieurs industries et notamment au secteur de la santé. Selon lui, l’innovation de rupture est un agent de transformation d’une industrie, et elle repose sur trois leviers :

  • Un développement de la technologie et du savoir en général du domaine qui deviennent de plus en plus accessibles
  • De nouveaux modèles économiques
  • Un nouveau réseau de valeur

Ainsi que tente de le montrer le graphe ci-dessus, au départ, une innovation en rupture est moins performante que ce qui peut exister sur le marché. Ceci est vrai jusqu’à ce qu’elle progresse pour, au final, redéfinir le marché (l’exemple de l’appareil photo numérique est pas si mauvais puisque l’on comprend qu’il fait sonner le glas de la pellicule argentique aujourd’hui devenu un marché de niche).

Selon beaucoup d’observateurs, le marché du séquençage va être profondément changé par l’amélioration de la technologie que propose ONT. Ainsi tel que le prévoit le modèle de Christensen, ONT va toucher des « consommateurs » qui n’ont aujourd’hui même pas connaissance du principe même du séquençage haut-débit. Pensons qu’aujourd’hui des botanistes échantillonnent à l’aide du MinION, des espèces végétales en Amazonie pour les séquencer afin de formellement identifier de nouvelles espèces.

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Donc au départ une technologie disruptive possède des performances dégradées par rapport à la concurrence… puis les améliorations successives permettent d’amorcer un franchissement exponentiel des lignes (rouges sur le schéma ci-dessus). Ces lignes sont liées aux applications, elles-mêmes fonction des performances attendues par les divers segments de marché.

Le 17 Octobre 2016 avec l’arrivée de la chimie 9.4 qui délivre ~ 10 Gb de débit avec une précision de 92% sur lecture 1D, et une précision de 99% + chez (certains) clients sur les lectures 2D (97% Sur leur site Web), il semble qu’ONT ait amorcé son exponentielle ascension. Ces améliorations remarquables de performance (accroissement du débit par un facteur de 40 au cours des 2 dernières années) ont permis à la technologie d’atteindre un point d’inflexion et peuvent maintenant satisfaire les attentes liées aux applications « bas de gamme » (les maladies infectieuses, l’analyse de microbiome, l’assemblage de novo, l’assemblage de petit génomes, et même les applications cliniques à moyen terme). Au 30 septembre 2016, la société dénombrait environ 3 000 unités sur le terrain pour plus de 2 200 clients. Sur la base des développements au cours des 2 derniers mois, nous prévoyons que ce nombre augmentera rapidement en 2017, car la société et la technologie (PromethION – environ une douzaine ont été expédiés à ce jour) continueront sur leur lancée.

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MiSeqDx

Il y a peu, le système MiSeqDx a été la première plate-forme de séquençage haut-débit approuvée par la FDA (US Food and Drug Administration) pour le diagnostic in vitro (IVD). Ceci élargit encore les applications de ces couteaux suisses de la génomique pour aller flirter avec les promesses d’une médecine de précision. C’était, en partie, le souhait des promoteurs des séquenceurs de paillasse (benchtop sequencer) du MiSeq en passant par le Ion Torrent pour aller jusqu’au prometteur séquenceur-clé USB, d’Oxford Nanopore. Ce dernier permet une analyse en temps réel des données générées par le séquenceur. Ce mode opératoire, le temps réel, trouve tout son sens dans le cadre d’applications cliniques où le temps est l’ennemi du clinicien.

Alors que les mappeurs permettant de confronter des reads générés à une référence génomique, sont optimisés pour être de plus en plus rapides, il est très étonnant voire absurde de constater que cette étape ne pouvait être réalisée qu’une fois le run de séquençage, terminé. Aujourd’hui, cet affront fait au bon entendement est en passe d’être réparé dans cette publication, d’octobre 2016, dans Bioinformatics où l’équipe de bioinformatique du Robert Koch Institute propose une première approche dans le sens d’une analyse en temps réel (à base d’extension de k-mers). Une affaire à suivre et un code source disponible : https://gitlab.com/SimonHTausch/HiLive

Source de l’article : HiLive – Real-Time Mapping of Illumina Reads while Sequencing, Bioinformatics. 2016 Oct 29

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Afficher l'image d'origineSi vous vous intéressez au séquençage haut-débit, que vous souhaitez avoir un panorama des diverses technologies à disposition et que vous êtes friands de schémas de principe: la publication de Sara Goodwin, John D. McPherson & W. Richard McCombie.  Cet article publié dans la revue Nature de mai 2016 promet de faire un retour en arrière sur 10 ans d’évolution du séquençage haut-débit. Elle parvient à tenir ses promesses et livre effectivement des schémas (avec la charte graphique « Nature ») très bien faits, très pédagogiques ! En outre, le tableau (Table 1 | Summary of NGS platforms) permet à tous les pourvoyeurs de projets nécessitant le recours à du séquençage, d’avoir un pense bête sous la main pour associer la bonne technologie à la question biologique qui leur incombe… Et comme vous êtes pressés, vous pourrez retrouver l’intégralité de cet article en vous promenant et cliquant sur l’image ci-dessous.

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Une jeune start-up est née en mai 2012 : cette société issue du CNRS est porteuse d’une innovation dans le secteur du séquençage haut-débit. Enfin, une alternative française aux anglosaxons qui  sont présents sur le marché depuis une dizaine d’année ! Maintenant… espérons que ce nouveau né n’arrive pas trop tard sur un marché animé par des fournisseurs de séquenceurs de 2ème génération (un marché mature) et d’autres fournissant des solutions de 3ème génération, riches de promesses.

PicoSeq derrière ce nom emprunt d’humilité se cache une technologie de séquençage des plus ingénieuses : en effet, SIMDEQ™ (SIngle-molecule Magnetic DEtection and Quantification) la technologie de PicoSeq utilise une approche biophysique pour extraire des informations à partir de la séquence d’ADN ou d’ARN.

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En s’appuyant sur cette représentation schématique tirée de Ding et al. (Nature Methods, 2012), on y voit un peu plus clair. Des fragments d’ADN ou d’ARN que l’on souhaite analyser servent de matrice pour la réalisation d’une librairie en «épingle à cheveux». Pour chaque épingle à cheveux, un côté d’un brin d’acide nucléique est attaché sur une surface solide plane et l’autre à une bille magnétique. En plaçant les billes dans un champ magnétique, modulant celui-ci de manière cyclique, les épingles à cheveux peuvent être auto-hybridées ou non (zip ou unzip). Ce processus peut être effectué des milliers de fois sans endommager les molécules constitutives de la librairie. La position de chaque bille est suivie à très haute précision permettant de voir ce processus d’ouverture et de fermeture en temps réel: nous avons donc là un signal brut permettant, en fonction de la force appliquée pour ouvrir totalement l’épingle à cheveu et des séquences d’oligonucléotides séquentiellement introduites dans le système de modifier la distance bille-support et de jouer sur le temps nécessaire où la force s’applique pour ouvrir l’épingle à cheveu…

PICOSEQ1

 

La figure ci-dessus (présente dans les données supplémentaires de l’article sus-cité) permet d’appréhender le potentiel de discrimination de la méthode… où le temps de blocage est fonction du nombre de mésappariements et de la position de ces mésappariements…

Finalement si l’aspect technique est intéressant puisqu’en rupture avec les méthodes proposées par PacBio certainement un peu moins avec le système proposé par Oxford Nanopore Technologies, si la perspective annoncée par PicoSeq est réellement séduisante: l’accès modifications épigénétiques de l’ADN, la question centrale est de savoir si le pas de la commercialisation (dans des conditions propices au succès) d’un tel outil, sera franchi.

Un article d’ Atlantico de septembre 2015, titré : les trois raisons pour lesquelles la France est incapable de rivaliser avec les géants américains de l’analyse ADN, est assez éclairant pour imaginer comment la concrétisation d’une preuve de concept peut être un chemin ubuescokafkaïen. Pour illustrer cela les propos de Gordon Hamilton, le directeur de la startup PicoSeq qui s’inquiète sur les entraves « typically french » peuvent faire office de témoignage. Ce dernier s’inquiète : « La qualité de la recherche scientifique (en France) est incroyable, l’une des meilleures » « le seul souci, c’est que l’on a beaucoup de difficultés ici à transformer ces recherches en vrai business » pour finir par citer en exemple les lenteurs administratives spécificités latines : « nous avons mis presque deux ans pour négocier les licences nécessaires aux brevets de Picoseq. Le même processus en Californie prend entre deux semaines et deux mois. Sur un marché aussi rapide que celui-ci, deux ans c’est très long. Tout change vite, c’est donc impossible pour nous d’être de sérieux concurrents de ces sociétés américaines qui ont toujours un temps d’avance ».

Oxford Nanopore Technologies (ONT) crée un nouveau marché pour le séquençage haut-débit: le séquençage (haut-débit ?) à la portée de tous et en mode tout-terrain… mais pourquoi faire ? Le principe de cette technologie a été abordé dans plusieurs de nos articles : les données produites sont constituées de longs reads (quelques milliers de bases frôlant les 10 kB de moyenne), des reads assez bruités au-delà de 10 % d’erreurs; suffisamment longs pour permettre une identification quasi-certaine mais encore trop bruité (et trop peu profond dans le format portable MinION et maintenant SmidgION) pour pratiquer un bel assemblage de novo.

Donc imaginez vous, perdu au fin fond de l’Amazonie à la recherche de cette plante évoquée par le « sorcier » de la tribu Mashco-Piro que vous venez de quitter, plante potentiellement inconnue de notre médecine occidentale… Qu’à cela ne tienne! vous marchez en quête de la dite plante, vous, votre panneau solaire, votre smartphone, vos appareils ONT (Voltrax + SmidgION). Quasi certain de vérifier in situ votre trouvaille à l’aide d’un séquençage de 3ème génération. Enfin, ceci serait parfait si l’on oublie que Metrichor (le BaseCaller d’ONT) fonctionne en ligne… (cf schéma ci-dessous)… malgré les rêves les plus fous de Google et autres Facebook le fin fond de l’Amazonie n’est pas couvert par la 4G ! On peut imaginer qu’une application pour nos téléphones intelligents devra accompagner la mise sur le marché de cette suite d’appareils pour permettre une analyse en mode stand alone.

 

SmidgION

METRICHOR
VolTRAX, l’une des promesses d’ONT, permet d’envisager la préparation de librairies à séquencer, ceci même perdu en pleine brousse. Par exemple, les nouveaux kits développés permettent une préparation d’une librairie en une dizaine de minutes. Que vous deviez séquencer un isolat du virus Zika ou Ebola sur le terrain (la logistique et le temps sont comptés) ou que vous deviez séquencer dans votre laboratoire favori, ce type d’automates permettant de simplifier les opérations relatives à l’élaboration de librairies de séquençage est souvent bien accueillis par les techniciens qui pourront s’adonner à des activités plus pertinentes.

 

Une heatmap (carte de densités) suite à un séquençage Ion Torrent évalue la densité de billes vivantes (porteuses d’une, ou malheureusement plusieurs, dans le cas de billes polyclonales, séquences matrice de séquençage).

Plus la surface de la puce de séquençage tire vers le rouge sombre plus important devrait être le nombre de reads séquencés. A l’inverse, le bleu sera indicateur d’une zone non pourvue de billes vivantes ou de billes tout court.

Ce premier indicateur de « qualité » de run est très précoce puisqu’il n’est pas nécessaire d’attendre la fin du run pour l’obtenir… ainsi une surface de puce en dégradés de bleus ne vous laissera aucune chance quant à l’exploitation des données (volume trop faible de reads). Il est à noter que la seule lecture de la séquence clé TCAG (portée par la matrice de séquençage) permet à la suite logiciel du PGM Ion Torrent de définir une bille vivante. Ainsi le rouge intégral est loin d’être un indicateur suffisant d’un séquençage satisfaisant.

Aujourd’hui à titre d’exemple nous avons obtenu lors de notre run cette heatmap (photo_Gaël Even) :

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Plutôt bien réalisée, voici la campagne d’Illumina pour le lancement de son nouveau séquenceur le NextSeq500, un nouveau séquenceur de paillasse. Ce dernier né des séquenceurs SBS est capable de délivrer de 16 à 120 Gb, selon les modes de séquençage, avec des spécifications permettant d’envisager le séquençage par run de 16 exomes ou 20 transcriptomes ou encore 1 génome humain (à plus de 30 X de profondeur). Quoi qu’il en soit, ce nouveau venu et la campagne marketing qui en résulte, visent à populariser, démocratiser encore et toujours le séquençage pour mieux inonder le marché, c’est parti avec cette publicité…

 

En ce début d’année, cet article est l’occasion d’aborder rapidement les divers axes de développements, les différents acteurs du séquençage haut-débit de deuxième génération.

– Commençons par Life Technologies et sa gamme Ion Torrent. En fin d’année 2013, la Ion Community (forum où  se retrouvent les utilisateurs de la technologie Ion Torrent) s’agite à l’annonce de 3 nouveautés majeures (early access program) :

(i) L’accès à une nouvelle chimie de séquençage, la Hi-Q ,  permettant d’accroître la fiabilité de séquençage.  Les erreurs seraient réduites de 90 %, ceci même au niveau des homopolymères, et pour des reads de 400 bases, témoignage de Dag Harmsen à l’appui ! En clair, il semble que ce soit l’enzyme (what else ?) qui ait été remplacé.

(ii) La deuxième annonce concerne l’arrivée de la chimie Avalanche où plusieurs heures d’amplification clonale à l’aide d’un automate One-Touch peuvent être remplacées par l’emploi d’un tube, ce qui prend alors 2 heures pour obtenir une librairie de 500 pb, et ce, de façon isothermique. Un choc de simplification qui ravira les utilisateurs pour lesquels cette étape est limitante.

(iii) La troisième annonce concerne la mise à disposition de kits permettant de réaliser des analyses métagénomiques ciblées 16 S. Un système exploitant le PGM et sa capacité de produire des reads de 400 pb. L’inconnu ici réside dans la mise à disposition de la communauté d’un pipeline analytique performant.

Qiagen, qui n’est pas connu pour être un acteur de poids sur la scène du séquençage haut-débit, arrive en force en cette année 2014 avec une solution intégrant tous les jalons nécessaires à la complétude d’une étude. Fort de son rachat d’une solution de séquençage (lire l’article : Qiagen investit… le séquençage haut-débit de 2ème génération), Qiagen propose un environnement logiciel des plus intéressants ! En effet, la société néerlandaise a racheté les sociétés CLC Bio et Ingenuity systems. Ces deux sociétés proposent l’une des toutes meilleures solutions d’analyse de séquences: une solution d’assemblage de novo réellement performante grâce à CLC genomics workbench, et Ingenuity systems proposant les pipelines d’analyses suivants: IPA, pour donner un sens biologique aux données omiques, Ireport pour l’analyse de données d’expression et Variant Analysis, un pipeline permettant d’optimiser la recherche de mutations causales.

Ainsi QIAGEN, à l’instar de ce que nous avons tâché de représenter par le schéma ci-dessous, possède actuellement tous les maillons (ou pas loin) d’une chaîne allant de l’échantillon à l’analyse finale traduisant des données de séquences en sens biologique.

Illumina, quant à elle, semble avoir l’ambition de devenir une sorte de Apple de la « génomicosphère ». En effet, Illumina propose BaseSpace, un Itunes pour les biologistes. D’ailleurs, notons qu’Illumina propose sur Itunes une application : MyGenome, qui propose « d’explorer un véritable génome humain » et d’afficher des rapports sur les variations génétiques importantes. « L’application MyGenome fournit une interface simple, intuitive, et éducative pour vous lancer à la découverte du génome humain« . Revenons à BaseSpace, une interface entre vous et un cloud hébergeant des applications et des données permettant d’analyser les séquences en sortie de MiSeq ou HiSeq. Ce cloud permet aux utilisateurs de délocaliser le stockage de leurs données. L’idée : simplifier au maximum l’analyse par la mise à disposition d’outils et la mise en réseau des utilisateurs. Illumina s’est aperçu que si le goulot d’étranglement constitué par l’analyse de données de séquençage haut-débit volait en éclat, nécessairement les runs pourraient se multiplier avec leur chiffre d’affaire. Le schéma ci-dessous reprend quelques éléments de la solution analytique développée par Illumina.

Une communauté de plus de 12000 utilisateurs, un espace permettant l’utilisation d’une vingtaine d’applications. L’objectif d’Illumina : créer un espace attractif, émulant et incitant les intervenants à mettre à disposition les applications développées en priorité sur cet espace. Anticipant une demande exponentielle d’analyses et d’espace de stockage lorsque le HiSeq a été intégré au BaseSpace, Illumina a décidé de mettre en place une politique de tarification qui limiterait la quantité d’espace libre pour stocker et traiter les données génomiques dans le cloud. En vertu de cette logique, les utilisateurs reçoivent un téraoctet gratuit d’espace pour le stockage et le traitement des données et seraient alors en mesure d’acheter du stockage supplémentaire par incréments de téraoctet ou 10 téraoctets – un téraoctet coûterait 250 $ par mois ou $ 2,000 d’avance pour une année complète , tandis que 10 téraoctets seraient à 1500 $ par mois ou une avance des frais annuels de $ 12 000 (données chiffrées début 2013).

En conclusion, si les années précédentes ont vu le lancement de nouveaux séquenceurs, avec depuis 2011 l’arrivée de séquenceurs de paillasse, les années 2013-2014 attendent la diffusion de séquenceurs de 3ème génération. Qiagen est un petit nouveau dans la course, ce nouvel acteur est capable, sans réel développement, de proposer une solution complète grâce à une stratégie de rachat pertinente. Illumina et Life Technologies, pendant ce temps, poursuivent leur développement en essayant d’émuler les utilisateurs avec, respectivement, leur BaseSpace et Ion Community. L’opérateur historique, Roche est le grand silencieux avec une stratégie peu lisible…

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Le séquençage haut-débit voit cohabiter depuis quelques années deux générations de séquenceurs.

Au passage, une question Trivial Pursuit pour laquelle il faudra avoir un œil de caracal : quelqu’un sait quelle société a développé la première génération de séquenceurs haut-débit ? et quand ?

Les séquenceurs de deuxième génération se voient conditionnés sous forme de séquenceurs de paillasse (PGM de Ion Torrent, Miseq d’Illumina, GS-junior de Roche) permettant une démocratisation du séquençage, pendant que leurs grands frères pulvérisent la loi de Moore pour envisager un rendement (coût / Mb) toujours plus compétitif.

La large diffusion du séquençage de 3ème génération se laisse désirer laissant le champ libre à la génération précédente. Cet article vise à réaliser un court état des lieux du séquençage haut-débit de troisième génération :  un futur plus ou moins lointain, de nouvelles applications potentielles.

La question : séquenceurs de 3ème génération, l’âge de raison, c’est pour quand ? est l’interrogation qui a hanté l’AGBT 2013 marqué par le silence d’Oxford Nanopore. Cette année 2013 fut marquée par le retrait d’Illumina du capital de la société britannique : « Oxford Nanopore Technologies Ltd a annoncé la vente d’une participation détenue par son concurrent américain Illumina Inc., une étape vers la fin d’une relation pleine de conflits dans la course au développement des séquenceurs haut-débit permettant de séquencer plus rapidement et pour moins cher. »

Avant de caractériser ce que sont, seront, pourront être les 3ème générations de séquenceurs, commençons par un rapide tour des caractéristiques générales de leurs prédécesseurs et principalement de ce qui constitue leurs points faibles :

– la phase d’amplification clonale (réalisée par PCR) est source de biais (doublons, erreurs de PCR)

– les problèmes liés au déphasage engendrant une chute de la qualité le long du read produit (ce qui bride la production de reads vraiment longs)

-des reads courts  (de moins d’une centaine à environ 800 bases – vous l’aurez noté ce point est en partie une conséquence du précédent)

-des machines et des consommables onéreux

– des temps de run longs

Ainsi l’objectif principal des séquenceurs de 3ème génération est de palier les défauts de leurs aînés en produisant des reads plus longs, plus vite pour moins cher. Les séquenceurs de 2ème génération, quels que soient leurs modes de détection (mesure de fluorescence, mesure de pH) sont trop peu sensibles pour envisager la détection d’une simple molécule, d’un simple nucléotide : nécessairement la librairie doit être amplifiée, ce qui provoque des biais, des temps de préparation relativement longs et l’usage de consommables qui impacte le coût final de séquençage… assez rapidement la qualité chute plus vos reads s’allongent ce qui oblige à brider les tailles de reads que ces technologies sont capables de délivrer. En outre, travaillant sur une matrice qui est une copie de votre librairie initiale, l’information portée par les bases méthylées est perdue (ceci oblige à ajouter une phase de traitement au bisulfite qui peut être hasardeuse)

Actuellement l’une des seules technologies de 3ème génération réellement utilisée est celle de Pacific Biosciences (les hipsters disent « PacBio »). La firme, fondée en 2004, a lancé en 2010, son premier séquenceur de troisième génération le Pacbio RS basé sur une technique de séquençage SMRT  (Single Molecule Real Time sequencing.) Aujourd’hui la société Roche qui n’a pu absorber Illumina lors de son OPA, a investi 75 millions de USD, le 25 septembre 2013, pour co-développer des kits diagnostiques in vitro exploitant la technologie de PacBio.

La technologie de PacBio est aujourd’hui exploitée pour réaliser du séquençage de novo de petits génomes :

Avec ces 200 à 300 Mb délivrés par SMRT-cell, séquencer des organismes eucaryotes supérieurs demande un investissement important, malgré tout, cette technologie délivrant des reads de plusieurs milliers de bases, permet d’envisager une diminution du nombre de contigs obtenus par les seules stratégies reads-courts / gros débit.

Face à la technologie proposée par PacBio, d’autres technologies essaient d’émerger pour arriver à occuper le marché du séquençage de 3ème génération :

– La combinaison détection optique et multipore est une voie envisagée pour le séquençage de 3ème génération avec le travail mené par NobleGen biosciences.

– L’imagerie directe de l’ADN

Le microscope électronique offre une résolution possible jusqu’à 100 pm, de sorte que les biomolécules et les structures microscopiques tels que des virus, des ribosomes, des protéines, des lipides, des petites molécules et des atomes même simples peuvent être observés. Bien que l’ADN est visible lorsqu’on l’observe avec un microscope électronique, la résolution de l’image obtenue n’est pas suffisamment élevée pour permettre le déchiffrement de la séquence, c’est à dire, le séquençage de l’ADN. Cependant, lors du marquage différentiel des bases de l’ADN avec des atomes lourds ou des métaux, un tel séquençage devient possible.

Le séquençage à l’aide de transistor (Transistor-mediated DNA sequencing– une technologie développée par IBM)

Architecture of the DNA Transistor

Dans le système conceptualisé par IBM, l’ADN est contraint de passer par le pore à cause de la tension électrique subie, la vitesse de passage de la molécule à séquencer est maîtrisée à l’aide de contacts métalliques à l’intérieur du nanopore. La lecture des bases serait réalisée lors du passage de l’ADN simple brin au travers du pore (ça rappelle quelque chose…)

– Et Oxford Nanopore dans tout cela ? Si la société anglaise a annoncé la vente de la participation d’Illumina, elle a marqué l’année 2013 par son silence assourdissant. Passé l’oxymore, en cette fin d’année, coup de poker ou réel lancement, Oxford Nanopore propose un programme d’accès à sa technologie Minion où pour 1000 USD, il est possible de postuler à l’achat des clés USB de séquençage.


La stratégie d’Oxford Nanopore est basée, en partie, sur la possible démocratisation du séquençage de 3ème génération, elle s’oppose à celle de PacBio qui mise sur son arrivée précoce sur le secteur du séquençage haut-débit : décentralisation contre l’inverse. En clair, l’investissement d’un PacBio est tel que l’outil est réservé à des centres, des prestataires de services pouvant assumer cet investissement, ce qui oblige à centraliser les échantillons pour les séquencer, contre les produits (encore en développement) d’Oxford Nanopore dont la promesse est : le séquençage pour tous (ou presque).

PacBio revendique sa participation à un projet qui consiste à doubler la quantité de génomes bactériens « terminés » (actuellement de 2384) en quelques mois.

En cliquant ci-dessus sur la représentation graphique qui illustre la différence de plasticité de génome entre le génome d’une Bordetella pertussis (l’agent pathogène responsable de la coqueluche) et celui d’Escherichia coli, un poster vous apparaîtra. Ce dernier reprend les caractéristiques de l’utilisation de la technologie de PacBio à des fins d’assemblage de novo de génomes bactériens par une stratégie non-hybride (seuls des reads de PacBio sont utilisés). Les résultats sont assez bluffants, la longueur des reads de PacBio permet un assemblage complet (au prix de plusieurs SMRT cells tout de même !), de génomes bactériens « difficiles » tel que celui de Bordetella pertussis connu pour posséder un GC % relativement élevé (environ 65 %) ainsi que de nombreux éléments transposables. Les génomes possédant de nombreux éléments répétés posent de grandes difficultés d’assemblage, c’est un des arguments qui permet à PacBio de positionner sa technologie actuellement… en quelques mois les stratégies hybrides (reads courts générés par des séquenceurs de 2ème génération) ont laissé place aux stratégies non-hybrides où le séquençage PacBio se suffit à lui-même.

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