Posts by: c.audebert
Cet article revient sur une publication de janvier 2012 de Science (voir image ci-dessous) qui exploite des données de biologie haut-débit pour répondre à deux questions biologiques liées : « comment a été permise la photosynthèse ? » – « toutes les plantes ont elles un ancêtre commun?«
Les auteurs exploitent des données génomiques et transcriptomiques d’un glaucophyte : Cyanophora paradoxa. Cyanophora paradoxa est le biflagellé le plus étudié des glaucophytes, pris pour modèle dans l’étude de l’endosymbiose et pour ce qui a trait à la fonction du proplaste à l’origine des chloroplates.
Ces proplastes ayant pour origine l’intégration par endosymbiose d’une cyanobactérie (les mitochondries quant à elles, ayant pour origine l’endosymbiose d’une alpha-protéobactérie). L’intégration de ces données apporte la preuve que toutes les plantes seraient issues d’un seul ancêtre commun: les plantes formeraient une lignée monophylétique.
Il y a plus d’un milliard d’années a eu lieu la rencontre entre une cyanobactérie et une cellule eucaryote : de cette rencontre a émergé des cellules capables d’exploiter la lumière solaire pour synthétiser de la matière organique. L’étude présentée ici distingue :
– les EGT (Endosymbiotic Gene Transfer) avec les échanges de gènes entre le génome de l’hôte et celui de la cyanobactérie initiale venant grandement enrichir le génome de cet hôte. La participation des gènes de cyanobactérie représenterait entre 6 % (pour Chlamydomonas reinhardtii) et 18 % (pour Arabidopsis thaliana). Chez C. paradoxa, 274 gènes semblent avoir une origine cyanobactérienne. L’étude de la séquence mitochondriale a permis de positionner les glaucophytes très près du point de divergence des algues vertes et rouges.
– une autre source d’apport de matériel génétique venant enrichir ce système : les transferts de gènes horizontaux (HGT). Les auteurs dénombrent 15 gènes qui sont partagés par les 3 taxons de plantes à l’origine d’une diversité de plantes, et qui auraient une origine bactérienne – des séquences proches de celles retrouvées chez des Chlamydiae et Legionella, des parasites intracellulaires de cellules eucaryotes.
Ainsi les gènes apportés par le parasite ont permis au couple cyanobactérie-cellule de fournir des gènes nécessaires aux échanges de « nourriture » (UhpC-type hexosephosphate transporters, des sous-unités de translocons). Cette étude démontre que ces échanges de gènes ont une signature unique chez les plantes, les algues et les glaucophytes confortant la thèse d’une lignée végétale monophylétique, un coup porté aux tenants de la thèse de la « paraphylie végétale ».
Cet article de Science est un bel exemple de l’exploitation, de l’intégration et enfin de l’interprétation donnant sens aux données génomiques et transcriptomiques générées à haut-débit (des données de transcriptomiques -réalisées sur la plateforme Illumina GAIIx- sont disponibles dans la banque du NCBI : Sequence Read Archive avec les n° d’accès suivants SRX104482, SRX104481, SRX104480).
L’AGBT qui a eu lieu du 15 au 18 février, à Marco Island, a fait la part belle à la technologie d’Oxford Nanopore, ainsi qu’il avait été prévu. La société dont il est question a profité du rassemblement pour lever le voile sur 2 produits : le MinION et le GridION, il est à noter que le MinION, mini-système de séquençage de la taille d’une grosse clé USB (photo ci-contre) a une dénomination commerciale tout particulièrement adaptée au marché français.
La technologie d‘Oxford Nanopore a été évoquée dans plusieurs de nos articles. Elle permet le séquençage et l’analyse à haut-débit de reads de taille ultra longue (plusieurs kb) en temps réel pour pas très cher : la promesse d’un séquençage de 3ème génération démocratisé. Clive G. Brown (directeur de la technologie chez Oxford Nanopore) a présenté ses deux nouveaux jouets :
– Le MinION (dont le prix serait inférieur à 900 $) est un consommable et séquenceur (les deux à la fois) jetable qui devrait permettre de générer 1 Gb de données
– Le GridION (que vous pouvez empiler à foison, voire photo ci-dessous) permet quant à lui de générer, par module, plusieurs dizaines de Gb / jour (on pencherait pour un minimum de 25 Gb) sachant que selon nos informations un module aurait un coût voisin de 30 k$. Oxford Nanopore insiste sur le fait qu’à la Gb générée ils seront concurrentiels en terme de coût des consommables. En outre, le volume de données générées s’adapte à la problématique de l’utilisateur puisqu’en effet tant que l’appareil séquence -d’où leur slogan « Run Until« – il génère des données (le débit journalier associé à une technologie prend tout son sens ici). La cartouche –consommable de séquençage– associée à la technologie GridION possède actuellement 2000 pores individuelles -en 2013, il est prévu de passer à un consommable en comportant 8000- avec cette évolution il sera donc possible avec 20 modules GridION (environ l’investissement équivalent à un HiSeq2000) de séquencer un génome humain en 15 minutes ! Une autre façon de voir les chose est la suivante, dans sa version « actuelle » à 2000 pores disponibles : pour un prix équivalent à celui d’une configuration de type Ion Proton, 5 modules GridION seront capables de séquencer un génome humain à 30 X (cela leur prendrait une demie journée).
D’autres éléments ont filtré lors de l’AGBT. En effet, il semblerait que la technologie d’Oxford Nanopore subisse un taux d’erreurs sur séquences brutes encore assez élevé de 4 % (comparé aux plus de 10 % pour la technologie de Pacific Bioscience). Clive G. Brown aurait laissé entendre que ce taux d’erreurs serait uniforme et le fruit d’une majorité d’erreurs systématiques (ce qui est plutôt bon signe, en vue d’une rapide amélioration du système). Au niveau du système de détection, une puce GridION comporte 2K capteurs (un par pore). Chaque capteur permet de distinguer 64 signaux différents, ceci a permis d’analyser le passage de triplets de base afin de pouvoir discriminer 4x4x4 profils différents (j’avoue que j’attendais plus : quid de la prise en compte d’un signal différentiel en cas de présence d’une 5-méthylcytosine ?).
Au niveau préparation des échantillons, un séquenceur de 3ème génération ne nécessite pas de phase d’amplification. Hormis une phase préalable de légère fragmentation de l’échantillon rien ne semble envisagé. Pour palier leur problème de fiabilité, on imagine aisément qu’à l’instar de Pacific Bioscience, une circularisation de l’ADN de l’échantillon permettra d’engendrer en séquençage un nombre suffisant de répétitions venant atténuer ce point négatif.
Un élément important -mais pas surprenant- réside dans la politique commerciale affichée : une distribution directe des machines ainsi qu’une adaptation tarifaire (en usant de forfaits) offrant la possibilité d’acheter la machine à prix réduit avec un report sur le coût des consommables devrait permettre à Oxford Nanopore de conquérir quelques marchés n’en doutons pas !
Laurent Wauquiez, ministre de l’Enseignement supérieur et de la Recherche, et Jean-Luc Tavernier, Commissaire général adjoint à l’Investissement, ont annoncé la liste des 71 lauréats de la deuxième vague de l’appel à projets « LABoratoires d’EXcellence« -fameux LABEX- doté d’une enveloppe de 1 milliard d’euros. La gestion du contenu de cette enveloppe a été confiée à l’Agence Nationale de la Recherche.
Voici un extrait du site : investissement-avenir.gouvernement.fr qui revient sur le bilan des dotations suite à cette deuxième vague du concours de l’excellence au service de la science… ou l’inverse… on ne sait plus trop :
« L’appel à projets a pour objectif d’attribuer aux laboratoires sélectionnés des moyens significatifs leur permettant d’accroître leur visibilité internationale, de faire jeu égal avec leurs homologues étrangers, d’attirer des chercheurs et des enseignants-chercheurs de renommée internationale et de construire une politique intégrée de recherche, de formation et de valorisation de très haut niveau.
195 projets ont été reçus pour cet appel et 71 ont été retenus (soit l’ensemble des projets classés A+ à A5 par un jury international, présidé par le Professeur Jean Claude Latombe, Professeur à l’université de Stanford).
Ces 71 laboratoires seront financés jusqu’en 2020 pour un montant de 534,5 M€, sachant que certains de ces laboratoires se trouveront financés dans le cadre des 8 Initiatives d’excellence désormais reconnues.
Les lauréats recevront dans les toutes prochaines semaines un acompte de 10% afin que les équipes sélectionnées puissent lancer leur projet dans les meilleurs délais.
Avec les lauréats de la première vague, ce sont donc 171 laboratoires d’excellence qui auront été sélectionnés pour un financement sur une période suffisamment longue pour leur permettre de déployer une stratégie scientifique de grande ampleur.
L’ensemble des domaines de recherche est représenté au terme de ces deux appels à projets : 14,5% en sciences du numérique et des mathématiques, 24% en sciences humaines et sociales, 20 % dans le domaine de la matière et de l’énergie, 14,6% dans le domaine des sciences de la terre et de l’environnement, 26,9% dans le secteur de la biologie-santé. »
Vous pourrez trouver le communiqué de presse comportant la liste des projets retenus accompagnée d’un court descriptif incluant les retombées économico-scientifico-sociales attendues (retour sur investissement) –> ici. Il vous suffit ou presque de regarder la carte présentée ci-dessus pour connaître les régions (ou villes universitaires) sur- ou sous-bénéficiants des investissements d’avenir… Lille devance légèrement Clermont-Ferrant et est supplantée par Strasbourg…
LABEX ou l’excellence… à tous les plats (nous avions abordé ce sujet précédemment). Une excellente lettre provenant de l’excellent blog d’Olivier Bouba-Olga, « un économiste qui suit et commente l’actualité » est disponible ici. Je vous invite chaleureusement à prendre connaissance de cette missive titrée : « l’excellence des Universités : oui, mais quelle excellence ?! ». Quelques « concepts » accompagnant la notion subjective d’excellence y sont passés en revue : de la notion de masse critique à la loi de Lotka.
Lotka a été le premier à réaliser, en 1926, une étude sur la distribution des auteurs scientifiques, arrivant à la conclusion que la relation auteurs-articles est inversement proportionnelle au carré d’articles publiés (une distribution hyperbolique)… cette constatation serait la résultante de ce que l’on nomme (en sociologie) « l’effet Saint Mathieu » qui peut être énoncé ainsi : le succès engendre encore plus de succès (ou la richesse réelle ou symbolique plus de richesse réelle ou symbolique)… Ainsi, ici transposé, le « concours » LABEX concentre des fonds très importants sur des têtes d’affiche… Quand l’état adosse sa politique d’investissements -d’avenir- sur la scientométrie, l’instrument de mesure fausse la mesure… en science on appelle cela l’effet de l’instrument…
Sequenom est une autre société californienne de biotechnologie (cotée au NASDAQ) basée à San Diego. Cette société développe des outils d’analyse génomique avec deux principales divisions:
– l’une d’elles développant des systèmes d’analyse génétique (type MassARRAY)
– l’autre se concentrant sur la recherche et développement de réactifs transférables sur la plateforme technologique développée par la première division.
Depuis 2008, Sequenom développe des outils analytiques de paillasse, les systèmes ‘MassARRAY’, appareillage compact permettant une mesure directe de la masse des acides nucléiques, offrant une précision inégalée quant à leur nature et leur quantification. Ce système, sur la base d’un spectromètre de masse, multi-MALDI-TOF MS, trouve des applications pour le génotypage, l’ analyse de la méthylation et l’expression génique. Sequenom continue d’affiner ces applications et de développer plusieurs nouvelles applications pour l’analyse de CNV (Copy Number Variation) par exemple.
Cette technologie est chahutée par les séquenceurs haut-débits de paillasse et autres systèmes permettant de génotyper une grande quantité d’échantillons tels que les systèmes proposés par Fluidigm. Le système MassARRAY bénéficie d’une sensibilité hors pair, les kits diagnostiques développés sur leur plateforme permettent à Sequenom de faire perdurer leur technologie. Les kits diagnostiques prénataux comme le MaternitT21 offre une alternative à l’amniocentèse pour diagnostiquer les trisomies 21, (en février 2012, Sequenom a lancé le MaterniT21 PLUS, permettant de diagnostiquer les trisomies 21, 18 et 13) de manière non invasive ciblant l‘ADN fœtal circulant dans le système sanguin maternel. Après des suspicions quant à un délit d’initié potentiel, des cadres de Sequenom sont surveillés par la SEC (Securities and Exchange Commission), de plus le développement des kits diagnostiques prénataux a connu des difficultés en 2010. En effet, la société a été condamnée à verser 14 millions de USD pour régler un recours (en « class-action ») : des actionnaires se sont retournés sur la société considérant que le développement du kit diagnostique de la trisomie 21 avait été plus que mal géré (notamment au niveau des essais cliniques).
La technologie MassARRAY est encore très employée pour le passage de cohortes suite à des études d’associations génétiques (les puces haute-densité sont employées dans un premier temps, suivi du passage des loci candidats sur une plateforme plus souple, telle que le MassARRAY, permettant d’interroger les mutations putativement associées au phénotype étudié). Un document en lien ici, reprend les principales caractéristiques de la plateforme de génotypage.
Bien que la plateforme MassARRAY trouve vite ses limites, la société Sequenom s’emploie à développer des solutions diagnostiques qui retardent l’obsolescence de leur technologie. La société a connu des soubresauts économico-judiciaires dont elle a su se relever, elle tente d’accélérer la diffusion de plusieurs de ces kits diagnostiques avant que sa technologie ne soit dépassée par la concurrence.
Le représentant européen des séquenceurs haut-débit de troisième génération, Oxford Nanopore va communiquer à l’AGBT… dans quelques jours. La société en profitera pour annoncer la commercialisation de ses premières machines permettant de séquencer en 24 heures un génome humain pour moins de 1000 $ (soit le même prix qu’un génome humain séquencé par un Ion Proton en 2 heures sur une plateforme de deuxième génération).
Oxford Nanopore souhaite commercialiser sa machine (en direct) avant la fin 2012. Un réelle course a lieu, puisqu’à cette échéance sera commercialisé le Ion Proton. Nous assisterons donc avant fin 2012 a un chevauchement technologique où 2ème et 3ème générations de séquenceurs risquent de se télescoper… les scientifiques en cours d’élaboration de dossiers de demandes de financements devront (vite) choisir leur camp… : partir sur une technologie qui a d’ores-et-déjà fait ses preuves (Ion Proton) donc de 2ème génération ou une technologie de 3ème génération totalement innovante… mais dont on ne possède pas de retour indépendant sur la qualité des données générées. La « guerre » technologique est lancée entre le transfuge de Solexa (technologie des séquenceurs Illumina), John Milton, le responsable scientifique d’Oxford Nanopore et la biotech’ rock-star Jonathan Rothberg, responsable scientifique de Ion Torrent chez Life Technologies.
A Davos en Suisse (dans la patrie de Roche) au forum économique mondial, Jonathan Rothberg présente son séquenceur Ion Proton, une évolution de son PGM de Life Technologies. La dépêche AFP (mise en forme par 20minutes est disponible en cliquant sur l’image ci-dessous) est dithyrambique replaçant la machine de Life Technologies dans le contexte et le champ d’application de la médecine personnalisée… jouant au passage du violon de l’affect. Le Ion Proton, fort de la démonstration menée par son petit frère le PGM depuis un an (200 machines PGM en Europe !) s’appuie sur l’efficience du séquençage à l’aide de semi-conducteurs.
Il parait évident que la médecine personnalisée aura un futur au sein des pays développés… mais il ne faut pas oublier qu’il s’agit d’un futur que l’on augurait aux puces à ADN, il y a plus de 10 ans, sans réelle démocratisation au sein des cliniques. Avant toute chose, permettre de séquencer l’équivalent d’un génome humain ou de 2 exomes humains pour la somme soutenable de 1000 $ (en 2 heures) laisse entrevoir une accélération des recherches biomédicales mais aussi de toutes les autres ! Cet outil qui torpille un MiSeq (Illumina) sorti trop tard, diffusera dans les laboratoires… il remporte, malgré ses défauts d’ores et déjà connus, la bataille du séquençage 2ème génération. Le prochain pari (plus aléatoire) porterait plutôt sur le séquençage 3ème génération dont la promesse est une lecture d’une molécule d’ADN ou d’ARN (non amplifiée artificiellement) dans son « état » originel (méthylé ou non par exemple). La 3ème génération unifie génomique et épigénétique.
Le Ion Proton devrait être livrable à partir d’octobre 2012, quelques chanceux pourront malgré tout réaliser des runs dès le milieu de l’année (il faut en acheter un minimum de 4 pour être un parmi ces privilégiés).
Un Ion Proton devrait avoir un coût proche de 140 k€ auxquels il vous faudra ajouter 65 k€ de serveur informatique.
La société suisse Roche tente de phagocyter la société californienne mastodonte, Illumina. Roche est prête à sortir un minimum de 5,7 milliards de USD de ses coffres suisses pour lancer une OPA inamicale – offre lancée le 24 janvier 2012 – sur la société leader de la biologie haut-débit. Illumina a été approchée par la société Roche afin de trouver un « terrain » d’entente, sans succès. Roche propose une offre valorisant l’action de 43 % par rapport à la valeur des cours des 3 derniers mois.
« Ensemble, les capacités de la division Diagnostics de Roche et d’Illumina, l’un des principaux fournisseurs de systèmes intégrés pour le séquençage de l’ADN, renforceront la position de Roche dans les secteurs Séquençage et Puces à ADN caractérisés par une demande croissante de solutions génétiques/génomiques », explique Roche, qui souligne qu’il « n’a pas ménagé ses efforts en vue de parvenir à une transaction négociée avec Illumina », mais que celle-ci « n’a pas voulu s’engager dans une discussion de fond ».
En temps de crise, les actionnaires ont bien souvent besoin de liquidité – valorisée qui plus est – il ne fait nul doute que cette OPA arrivera à ses fins… il ne s’agit pas nécessairement pour les scientifiques d’une excellente nouvelle, tant la concentration aux mains de peu se ressent par le moins de développement et des coûts croissants à supporter au niveau des laboratoires… Nous assistons à la création, au niveau des sociétés de biotechnologie, d’un monde bipolaire : Life vs Roche !
Le communiqué de presse de Roche concernant cette OPA est disponible ici.
Chaque année depuis 13 ans, l’AGBT (Advances in Genome Biology and Technology) rassemble les fournisseurs de technologies de pointe, quelques « maîtres » en la matière venant dispenser des cours du soir (sorte de « master-class ») et beaucoup de scientifiques essentiellement Nord-Américains. En effet, cette grande messe de la biologie haut-débit a lieu à Marco Island, île de Floride, lieu de villégiature pour retraités liftés percevant leurs fonds de pension sous forme de rente viagère.
La Côte Est américaine accueille les grandes entreprises de biotechnologies de la côte opposée pour démontrer que la Californie avec des sociétés telles que Illumina, Life technologies, Roche, Pacific Biosciences, Agilent… reste le meilleur fournisseur de technologies de pointes pour les gros centres de recherches situés sur la Côté Est (NIH, MIT-Broad Institute, Yale…). La Côte Est héberge les deux tiers des séquenceurs haut débit nord-américains. Depuis quatre ans, il faut bien le dire l’AGBT consacre le séquençage haut-débit, technologie qui vampirise la plupart des présentations (n’oublions pas que la jeune société PacBio sponsor principal, vend des séquenceurs…) et sessions « workshop »… au détriment de technologies plus « anciennes » (les puces à ADN par exemple). On le sait, ce type de rassemblements adoube la nouveauté et consacre ce que, parfois, hâtivement, on nomme : innovation.
Bien que ces rassemblements endogames sont critiquables, ils constituent une tribune pour les principaux axes de développements des technologies appliquées au vivant. L’AGBT est un tremplin dont se servent un grand nombre de firmes californiennes pour annoncer des lancements de machines à générer de la séquence. Cet évènement très américanocentré n’a pas de réel pendant européen, malgré les différentes formes prises par des rassemblements tels que le « carrefour des biotechnologies » remplacé par l’Eurobio-event. L’Eurobio-event sorte de biennale biotech’ où l’on trouve rassemblés beaucoup de vendeurs de robotiques, de pipettes… beaucoup de conférences traitant du business, de l’investissement dans les biotechnologies plus que des biotechnologies en tant que technologies. Assez peu de science dans Eurobio-event, beaucoup de business.
L’AGBT oscille quant à elle, entre un monde de scientifiques avide de nouvelles méthodes visant à l’exploitation rationnelle des flots de données issues de la biologie haut-débit (ce que représente l’illustration ci-dessus) et un monde de vendeurs de solutions appliquées à la recherche en biologie – quand les uns partagent un même « problème » et réfléchissent à une solution optimale pour sortir du sens biologique d’un amas de données, les autres vendent les générateurs de « problèmes » en misant sur la communauté scientifique mondiale pour apporter la réponse aux nouveaux problèmes générés. Il s’agit de trier l’information émanant de ce type de rassemblements en n’oubliant pas que cette vitrine – telle que peut l’être l’AGBT ou tout autre évènement de cette ampleur – peut parfois être un mirage scientifique plus qu’un virage technologique…
L’AGBT cette année 2012 aura lieu du 15 au 18 février sur l’île Marco Island : http://agbt.org/about.html, on y parlera de la technologie de Pacific Biosciences (des retours sur expériences sont prévus, avec leur 15 % de taux d’erreur de séquençage, il s’agit de LA déception technologique de l’année, mais PacBio est aussi LE sponsor principal de la réunion, quel suspens !), on y parlera aussi du futur Ion Proton…
Depuis la publication de 2006, d’Astier and al., J. Am. Chem. Soc., la communauté scientifique attendait la révolution du séquençage 3ème génération que constituait la géniale idée d’Oxford Nanopore : à savoir l’alliance des nanotechnologies, du génie génétique le tout à des fins de séquençage (et plus si affinité). Ainsi, un pore d’alpha-hémolysine (d’environ 1 nanomètre) ou la porine A de Mycobacterium smegmatis ou bien encore du graphène ont été investigués pour devenir le pore idéal dans lequel, après clivage par une exonucléase des liaisons phosphodiester, les bases azotées dont l’enchaînement constitue le séquençage passe afin d’être analysées (par analysées on entend lues, la lecture étant basée sur la différence de conductance électrique liée à la nature chimique des bases azotées). Le pari, pour Oxford Nanopore réside dans le fait de trouver un mode de détection suffisamment sensible pour analyser puis par puis un signal généré par le passage d’une base au travers de pores (autrement appelés trous). La résolution de la technologie constituait un défit, sa faiblesse provenait (espérons que ce verbe se conjugue aujourd’hui au passé) de la rapidité de passage des bases à travers le pore (1 à 5 µs / base)…
Une attente à émouvoir un James Dewey Watson, plusieurs publications en guise de démonstration de la faisabilité d’un tel séquençage, des appels de fonds ayant abouti à l’intégration d’Illumina au niveau du capital d’Oxford Nanopore (investissement en deux fois d’abord de 28 millions $ puis de 41 millions) ont maintenu en haleine les scientifiques avides de séquençage 3ème génération.
Oxford Nanopore est l’un des seuls acteurs européens, dans le monde du séquençage haut-débit où l’hégémonie californienne est écrasante… Alors que les Californiens (PacBio, Life, Illumina) communiquent à grand renfort d’annonces choc, Oxford Nanopore garde une part de mystère (aucune spécification réellement disponible à ce jour), nourrissant notre curiosité avec quelques publications scientifiques et quelques animations dont certaines vous sont présentées ci-dessous.
http://vimeo.com/18630569
Cette première animation reprend les différentes modalités de séquençage
http://vimeo.com/20289048
Avec la vidéo ci-dessus et celle ci-après, Oxford Nanopore réinvente le magnétoscope VHS à visée séquençage haut-débit…
http://vimeo.com/19288315
Finalement, le message à peine subliminal de ce court article : Oxford Nanopore est une société à surveiller de près… de plus en plus près.
Note : si les liens vers les vidéos ne fonctionnent pas essayer toujours en suivant celui-ci…
La HRM est une technique accessible (en temps/finance) sous diffusée. Loin d’avoir l’ambition de réparer cette injustice (à mes yeux), cet article vise à aborder une technique analytique de biologie moléculaire survolée, méconnue et snobée à l’heure de la biologie haut-débit.
La HRM (High Resolution Melt, Courbe de Fusion à Haute-Résolution) permet de distinguer des amplicons (produits PCR) variant d’un minimum de 1 base… (avec plus ou moins de difficulté selon que la mutation concernée est une transversion A/T ou un INDEL par exemple). Cette technique est l’alliance de machine qPCR permettant un contrôle fin de la température (pour ce qui nous concerne nous sommes les heureux possesseurs d’un RotorGene 6000, de Corbett dorénavant vendu sous le nom de Rotor-Gene Q, Qiagen) et d‘agents intercallants de l’ADN saturants et moins « toxiques » pour la PCR comme peut l’être l’EvaGreen. Au rayon des molécules fluorescentes pour cette application vous pourrez trouver le LC Green et LC Green Plus , le ResoLight, Chromofy, SYTO 9 et le SybrGreen I bien sûr ! (de toute évidence sur la plateforme RotorGene, cette molécule permet de bons résultats). Ainsi que le montre les courbes ci-dessous, après amplification, les produits de PCR sont chauffés jusqu’à complète dénaturation par pas de température les plus fins possibles, plus ceux-ci sont petits, plus la technique est résolutive. Le point d’inflexion (l’endroit où la dérivée s’annule) reporté en abscisses est le Tm du produit PCR préalablement amplifié. Or le Tm d’un produit PCR est dépendant de sa concentration, de la concentration en sels du milieu dans lequel il est solubilisé mais surtout de sa composition en bases azotées.
L’hétéroduplexe (la forme hétérozygote) montrera une courbe avec 2 points d’inflexions (ainsi que vous pouvez l’observer sur la courbe ci-dessus). Les 3 populations : homozygotes AA et BB, ainsi que la forme hétérozygote AB se distinguent entre elles.
Au niveau des stratégies de design puis d’analyse, un document plutôt bien réalisé est disponible ici. Les plateformes permettant de réaliser de « vraies » courbes HRM possèdent un logiciel permettant une normalisation qui facilite grandement l’interprétation des résultats.
Les applications de cette techniques sont évidentes :
– le génotypage à bas débit et très bas coût : de simples amorces suffisent (nul besoin de sondes internes doublement marquées) un mastermix contenant un fluorochrome et le tour est joué (il sera judicieux d’avoir sous la main des échantillons références homozygote des deux formes, au minimum). Bien designé, ce diagnostic de génotypage permet une discrimination des substitutions A/T (SNP de classe 4) les plus difficiles à distinguer compte tenu de la faible différence de Tm (autour des 0,2 °C) entre les deux formes.
– le criblage (screening) de mutants : cette application permet de réaliser un premier filtre en vue d’un séquençage (par exemple) sur des zones courtes de l’ADN potentiellement impliquées dans un phénotype particulier. La reproductibilité et la sensibilité de la technique est correcte comme le montre l’article Tù Nguyen-Dumont et al., BMC 2011
– méthylation de l’ADN : recherche de base 5-méthylcytosine (à l’aide d’un protocole bi-sulfite permettant de « remplacer » les cytosines non méthylées par des uraciles) à l’instar de ce que développe la publication dans NAR de Tomasz K. Wojdac et Alexander Dobrovic. Cette étude montre que l’intermédiaire de la MS-HRM (Methylation-Sensitive High Resolution Melting) il est possible de distinguer des zones méthylées à 0,1 % (ainsi que les courbes tirées de l’article sus-cité montrent pour des sensibilités descendant jusqu’à 1% d’amplicons méthylés, visibles ci-dessous).
En conclusion, la HRM est une technique largement méconnue et sous-employée, relativement simple à développer. Il est nécessaire de normaliser la concentration des échantillons (afin que ceux-ci aient des courbes d’amplification franchissant le seuil autour des 25 Ct). Dans l’idéal, la concentration en sels ne doit pas varier entre les échantillons… appuyé sur un bon design… et le tour est joué. De plus amples informations sont disponibles sur le site gene-quantification.info (la référence en matière de qPCR) ainsi que sur le site highresolutionmelt.co.uk.
Qui sommes nous?
Christophe Audebert [@]
En charge de la plateforme génomique
du département recherche et développement
de la société Gènes Diffusion .
Renaud Blervaque [@]
Biologiste moléculaire, chargé d'études génomiques.
Gaël Even [@]
Responsable bioinformatique au sein
du département recherche et développement de la société Gènes Diffusion.
