Résultat de recherche d'images pour "qPCR design"

La qPCR est une méthode permettant de doser la quantité d’acides nucléiques ciblés introduits dans une réaction de PCR. Pour des raisons de rapidité, de sensibilité et de coût, souvent l’option de travailler avec un agent intercalant (sans sonde) est choisie. La bonne vieille qPCR SybGreen nécessitant le seul design d’une paire d’amorces…

Simple ? Pas nécessairement, car cette approche, certainement plus que la version qPCR Taqman nécessite un travail in silico et de validation/optimisation expérimentales comme passages obligés. C’est ce que montre la publication de Stephen Bustin et Jim Huggett dans Biomolecular Detection and Quantification. Cette publication incontournable pour les férus de qPCR SybrGreen est un beau travail pour lequel la publication vous est mise à disposition en cliquant ci-dessous. On attend ardemment une déclinaison Taqman, HRM, MolecularBeacon de ce type de revues permettant de formaliser des procédures visant à optimiser l’approche d’optimisation.

qPCR primer design revisited

 

La quantification par qPCR SybrGreen suppose une relation linéaire entre le logarithme de la quantité initiale introduite en PCR et la valeur Cq obtenue lors de l’amplification. Ceci permet de calculer l’efficacité d’amplification d’un test et de borner ses limites de détection et de quantification. Les caractéristiques d’un test qPCR (bien) optimisé sont les suivantes:

• Une excellentissime spécificité révélée par un pic unique lors de l’établissement de la courbe de fusion

• Une efficacité d’amplification élevée (95-105%)

• Une courbe étalon linéaire (R2 > 0,980)

• Une bonne répétabilité

• Peu ou prou de dimères d’amorces

Pour paraphraser la conclusion de l’article, afin de finir par convaincre de lire cet « essentiel » de la qPCR :

La conception, le design d’une PCR est souvent au cœur de tout projet de recherche visant à quantifier les acides nucléiques. Il doit être réalisé avec soin, mais peut être simplifié en suivant un flux de travail simple, comme décrit ci-dessus (cf. diagramme workflow design qPCR).

Cela signifie généralement une spécificité absolue, l’absence de structures en épingle à cheveux ou de potentielles dimérisations croisées. Une bonne conception des essais doit tenir compte de la structure de l’amplicon (paramètre souvent négligé) et veiller à ce que les cibles de l’amorce soient exempts de structure secondaire. Il existe de nombreuses opinions et lignes directrices; une recherche sur Internet pour les termes « qPCR Assay Design » renvoie 695.000 pages. Cependant, bon nombre de ceux-ci sont basés sur des mythes ou peuvent être appropriés pour la PCR mais nécessitent des modifications subtiles (ou moins subtiles) pour être utilisés pour développer une qPCR. Chaque « nouveau » dosage doit être correctement validé, la validation in silico servant de filtre initial pour éliminer des designs ne permettant pas d’aboutir à une bonne qPCR. L’optimisation et la validation empirique sont une partie essentielle, mais souvent négligée, de toute expérience qPCR. Cela s’applique aussi bien aux essais nouvellement conçus qu’aux essais obtenus en reprenant des amorces issues d’une publication, par exemple. Avec tant d’essais prêts à l’emploi, on peut se demander pourquoi quelqu’un voudrait se donner la peine de concevoir un autre essai. D’autant plus que l’on a l’impression que la conception de son propre test est beaucoup plus complexe et peu commode que de simplement l’acheter à un fournisseur commercial, qui en tout cas aura validé chacun de ses tests. Cette perception est erronée pour deux raisons:

1° il se peut que les amorces commerciales ou les conditions d’analyse n’aient pas été validées ou optimisées de façon expérimentale.

2° on ne peut pas présumer qu’un ensemble d’amorces produira les mêmes résultats dans des conditions expérimentales différentes puisque la performance du dosage peut varier selon les méthodes d’extraction utilisées pour purifier les acides nucléiques.

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Ce billet très court, pour faire l’annonce (un peu tardive) du début d’un MOOC. Ce dernier s’annonce excellent, traitant du séquençage de génomes complets bactériens.

Université technique du Danemark (DTU)

Ce cours estival est proposé par l’excellente Université Technique du Danemark (DTU)

En voici le plan :Résultat de recherche d'images pour "whole genome sequencing coursera"

WEEK 1
Module 1
Welcome and introduction to typing of bacteria and use of Whole genome sequencing applied to surveillance of bacterial pathogens and antimicrobial resistance
3 vidéos

WEEK 2
Module 2
Introduction to Next Generation sequencing
3 vidéos

WEEK 3
Module 3
Whole genome sequencing tools- demonstration of analysis tools for species identification, MLST typing and finding resistance genes
3 vidéos

WEEK 4
Module 4
Whole genome sequencing tools- demonstration of analysis tools for Serotyping of Salmonella and Escherichia coli strains , and finding plasmid replicons
3 vidéos

WEEK 5
Module 5
Whole genome sequencing tools- demonstration of analysis tools for multiple analyzes, phylogenetic tree building and finding genetic markers from self-made databases and Summative Tutorial exercise
5 vidéos, 1 lecture
Noté: Tutorial final Quiz

 

Avec humour et sans complètement tomber dans la caricature extrême, cette infographie met en lumière le travail protéiforme des chercheurs & enseignants-chercheurs, ces hybrides qui naviguent entre laboratoires et amphithéâtres. Plombés par des tâches administratives… il faut dire qu’ils sont bien aidés par du personnel administratif parfois un peu mono-tâche (à café) soucieux de faire coller son volume horaire pratique à la théorie, les chercheurs et enseignants-chercheurs sont les rares personnes à devoir chercher leur propre budget pour répondre à l’injonction d’accroître le corpus de connaissances, en étant tour à tour : évalués, évaluateur, éditeur, vulgarisateur, secrétaire, encadrant de stagiaire de thésards, professeur, RH…

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Tout ceci m’a remis en mémoire, ce dessin de Charb issu des cahiers pédagogiques…

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Résultat de recherche d'images pour "pipeline"Pour avoir connu moult galères dans la quête d’un jeu de données (en l’occurrence issu de Ion Torrent) afin de tester des versions de pipelines analytiques ou pour optimiser les paramètres de ceux-ci, nous avons décidé de publier un jeu de données, les résultats en sortie de pipeline et les conclusions statistiques puis biologiques qui en découlent. Avant, dans et après la moulinette bio-informatique.

En espérant, que ceci puisse éviter des galères à d’autres…  :

Targeted metagenomic sequencing data of human gut microbiota associated with Blastocystis colonization

 

Concernant l’exploitation « biologique » de ce jeu de données, l’article publié dans Scientific Data est rattaché à celui-ci :

Colonization with the enteric protozoa Blastocystis is associated with increased diversity of human gut bacterial microbiota

 

Targeted metagenomic sequencing data of human gut microbiota associated with Blastocystis colonization

Voici une illustration, sous forme d’une caricature, de l’évolution des injonctions ressenties par les chercheurs académiques… la course à l’excellence et la quête du facteur d’impact comme ligne d’horizon.

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Résultat de recherche d'images pour "metasub"Voici une initiative originale conciliant deux tendances du moment : étude d’un microbiote & le concept de smart city. Saugrenu ? Science tendance ? Projet formaté pour la vulgarisation, la valorisation médiatique ? Quoi qu’il en soit, ce projet nous est plutôt bien vendu, à grand renfort d’infographies, de photographies, de vidéos un peu inquiétantes de personnes en train de réaliser des prélèvements de surface dans le métro. Derrière la communication, l’idée du projet est séduisante : utiliser des données biologiques, en l’occurrence des profils de l’ADNr 16S ou des séquençages génomes entiers définissant un microbiote pour améliorer nos écosystèmes urbains. Il est vrai qu’à une époque où l’on conçoit du mobilier urbain volontairement inconfortable pour ne pas que le passant puisse faire autre chose que passer, il ne semble pas intuitif d’aller chasser le microbiote pour concevoir une ville moins idiote. Même si la ville est le terrain de tous les paradoxes, il est captivant d’observer que cet environnement quotidien, banal, renferme une part de mystère… mystère qui serait à l’origine des odeurs du métro ? quelles espèces bactériennes propres à New York, Paris ou Rome sont à découvrir… quelle ville a le microbiote le plus diversifié ? quelle est celle qui aura le privilège d’héberger le plus de bactéries résistantes aux antibiotiques, la plus propre ou la plus sale ?

Résultat de recherche d'images pour "metagenomic subway"

 

En juillet 2017, Stockholm accueillera la 3ème conférence annuelle « Metagenomics and Metadesign of Subways and Urban Biomes (MetaSUB)« , qui rassemblera des chercheurs dédiés à la cartographie du métagénome urbain de plus de 67 villes à travers le monde (dont Paris et Marseille). Ce projet ambitieux a débuté il y a deux ans, alors que le professeur Christopher Mason et son équipe ont réalisé la première étude sur la microflore de surface, dressant le microbiome de la ville de New York. Avec ces données moléculaires essentiellement basées sur le séquençage haut-débit 16S, le projet a étudié la façon dont ce «microbiome urbain» change avec des variables telles que la météo, la propreté, les matériaux de construction et même les niveaux socio-économiques du quartier. L’équipe a cherché à établir des profils de microbiotes dans le métro, à identifier les bio-menaces potentielles et à fournir des données complémentaires qui peut être utilisé par la ville pour créer une «ville intelligente», c’est-à-dire qui agrège des données hétérogènes pour améliorer son urbanisme.

Près de la moitié (48%) de l’ADN séquencé ne correspondait pas aux organismes connus, soulignant qu’un microbiota incognita entoure les usagers du métro. Le projet du métro de New York n’était que le début, ce qui a conduit à la création d’un consortium international de laboratoires pour établir une « cartographie » mondiale de microbiomes dans les systèmes de transport en commun notamment.  En cliquant sur la capture d’écran ci-dessous, on pourra se faire une idée de la communication « Metasubienne » qui n’a rien à envier à celle de Tara Oceans ou de MetaHit (qui sont toutes trois, d’excellentes communications autour d’un projet et d’un consortium).

MetaSUB

Voici en quelques mots les promesses annoncées dans l’article Geospatial Resolution of Human and Bacterial Diversity with City-Scale Metagenomics (Cell Syst, 2016) :

« La région métropolitaine de New York City (NYC) est un endroit idéal pour entreprendre une étude métagénomique à grande échelle car c’est la plus grande et la plus dense des États-Unis; 8,2 millions de personnes vivent sur une masse continentale de seulement 755 km2. En outre, le métro de New York est le plus grand système de transport en commun dans le monde (par le nombre de stations), qui s’étend sur plus de 406 km et utilisé par 1,7 milliard de personnes par an. Ce vaste écosystème urbain est une ressource précieuse qui nécessite un suivi pour le maintenir et le sécuriser contre les actes de bioterrorisme, les perturbations environnementales ou les épidémies. Ainsi, nous avons cherché à caractériser le métagénome de NYC en examinant le matériel génétique des microorganismes et d’autres ADN présents dans, autour et au-dessous de New York, en mettant l’accent sur les métros et les zones publiques très empruntés. Nous envisageons cela comme une première étape vers l’identification des menaces biologiques potentielles, la protection de la santé des New-Yorkais et la mise à disposition de données moléculaires qui pourront être utilisée par la ville pour créer une «ville intelligente», c’est-à-dire celle qui utilise des données de grande dimension pour améliorer l’urbanisme, la gestion de l’environnement bâti, des transports en commun et de la santé humaine. »

Résultat de recherche d'images pour "fermenteur"L’objet de ce petit article est de mettre en lumière cette industrie qui se porte plutôt pas mal en France. Après un petit retard à l’allumage, en atteste les craintes formulées dans des articles de 2008- 2009, « Bioproduction en France, toujours un train de retard« , il s’agit d’un secteur en relative expansion. Quand on parle de bioproduction, de quoi parle t’on ? La bioproduction peut être définie comme la production des produits de santé d’origine biologique et biotechnologique. En clair, à partir de briques du vivants on formule un produit à allégation santé (anticorps monoclonaux, les protéines recombinantes comme l’insuline  ou encore les vaccins sont des outils indispensables au traitement de nombreuses pathologies), en substance la bioproduction pourrait être comparer voire parfois opposée à la pharmacochimie.

La carte obtenue par le LEEM –  le syndicat du milieu pharmaceutique qui s’est substitué en 2002 au Syndicat national de l’industrie pharmaceutique (SNIP)- fait apparaître un regroupement de l’activité autour de quatre bassins principaux :
– la région Rhône-Alpes
– la vallée de la Seine
– l’Alsace
– le département du Nord

13_Bioproduction _ La France est-elle dans la course de la bioproduction _
L’état des lieux de 2014 du LEEM est plutôt évocateur :
– La demande en biomédicaments est passée de 5 à 15 % entre 2000 et 2012.
– La France dispose notamment de capacités de production significatives dans le domaine des vaccins, des produits dérivés du sang, des hormones et des produits pour le diagnostic.
13 000 personnes sont employées dans la bioproduction
Les formations françaises en biotechnologies sont reconnues au niveau international. Il en va de même pour le processus de reconversion des industries chimiques vers le vivant. Cette synergie de compétences est un atout.

15_Biotechnologies _ Les biotechnologies, clés du développement économique de l’industrie du médicament _

Outre ces éléments visant à saluer une filière qui a su prendre un bon élan, d’un point de vue plus pratique, ce post est aussi l’occasion de fournir une liste de ces entreprises qui recherchent des profils plutôt jeunes et plutôt bien formés. Cette liste est évidemment non exhaustive et tirée de l’excellent recensement de l’Industrie Pharma Magazine.

11_Biomédicaments _ Les nouveaux médicaments seront-ils tous issus du vivant _

 

 

Evry_therapie_genique

 

Voici un outil simplissime, rapide, en ligne, permettant de designer et de qualifier informatiquement des sgRNA, dans un contexte de KO réalisé par CRISPR/Cas9.

Vraiment pas mal !

Cliquez sur la capture d’écran ci-dessous et tentez votre design.

Synthego

 

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Résultat de recherche d'images pour "ORCID"Voici une infographie tirée du  Monde Science et Techno du 23/05/2017. Celle-ci a été permise grâce au numéro ORCID qui permet d’identifier, de façon non ambiguë tout chercheur contributeur d’une publication scientifique. Selon l’Open Researcher and Contributor ID, « ORCID est une organisation à but non lucratif qui a pour objectif d’aider à créer un monde dans lequel tous les intervenants dans les domaines de la recherche, de l’université et de l’innovation sont identifiés de manière unique et sont reliés à leurs contributions et à leurs affiliations, au-delà des limites des disciplines, des frontières et des époques. » Concernant les migrations de chercheurs, l’Union Européenne et les Etat-Unis restent attractifs. En France, un cinquième des chercheurs ayant obtenu leur diplôme sur le territoire, émigre, ce qui est plutôt beaucoup… une question peut se poser : est ce que la proportion de chercheurs quittant leur pays d’obtention de doctorat ne serait pas inversement proportionnelle à l’intérêt de ce pays pour sa propre recherche scientifique…?

Ce « marqueur » – le taux d’émigration des chercheurs diplômés du pays qu’ils quittent- peut, en même temps, être lié à une bonne santé d’un système éducatif et de formation.

En effet, plus les étudiants diplômés seront perçus comme bien formés plus ils auront de facilités à le quitter, attirés par des pays dont la recherche est plus dynamique (entendons par là des pays rémunérant mieux, offrant de meilleurs capacités d’accueil) que celui dans lequel ils ont obtenu leur diplôme. En définitive, cette proportion, ce marqueur peuvent en quelque sorte être liés à une distorsion entre deux capacités pour un pays : celui de former et celui de réaliser une recherche de haut niveau permettant de garder les chercheurs que ce même pays a formé.

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Résultat de recherche d'images pour "london calling nanopore"Le London Calling a été l’occasion pour Oxford Nanopore Technologies (ONT) de frimer un peu avec des annonces et une gamme de séquenceurs ciblant des marchés très différents. Cette technologie de rupture risque d’être un tsunami technologique pour finir par déferler dans nos vies, car avec un séquenceur qui tient dans la poche et se connecte à un smartphone, ce qui était hier science fiction devient réalité.

ONT a fourni, en ce début de mois de mai 2017, informations concernant les développements technologiques et les perspectives de commercialisation. L’une d’elles, concerne une nouvelle « flow cell » pour MinIon, appelée Flongle (Flow Cell Dongle) pour les applications de diagnostics cliniques. Le développement du Flongle aidera également le travail de l’entreprise sur SmidgION, un séquenceur miniature avec de petites flow cells alimentées par un téléphone mobile (voir la photo ci-dessous).

Clive Brown, responsable technologique d’ONT, a donc présenté diverses mises à jour lors du « London Calling 2017 », le grand barnum des utilisateurs de la technologie, en ce début de mois de mai. En ce qui concerne le séquenceur MinION, Brown a déclaré que la technologie est d’ores et déjà capable de délivrer plus de 20 Gb de données par run de 48 h. (Actuellement, les utilisateurs sont plus autour des 15 Gb, ce rendement plus limité serait partiellement lié à la préparation de la bibliothèque, en particulier la quantification appropriée de la taille et de la quantité d’ADN de départ, selon Brown).

En mars, la société avait parlé d’une nouvelle méthode de séquençage, appelée séquençage 1D2, où les deux brins d’une librairie bicaténaire sont poussés par nanopore séquentiellement sans être physiquement connectés. La méthode contourne un brevet détenu par Pacific Biosciences et aboutit à des lectures plus précises que la seule lecture 1D, où seul un brin de la librairie constituée est séquencé. ONT prévoit de publier le kit de séquençage 1D2 courant mois de mai 2017, ainsi qu’une nouvelle chimie appelée R9.5. Les kits 2D ne sont plus disponibles et l’entreprise vient juste d’interrompre les anciennes cellules R9.4.

Dans l’ensemble, la précision de lecture brute est maintenant supérieure à 90 % pour la chimie R9.4 et supérieure à 95 % pour la  R9.5 (en mode 1D2), ces deux chimies tournant à 450 bases / min.

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Ci-dessus, les prix actuels de la chimie 9.5. Là où l’on constate que le prix décroit drastiquement avec la quantité commandée… je pense qu’une mutualisation ou la création d’une centrale d’achats s’imposent ! Avec cette nouvelle chimie,ONT a diffusé une nouvelle version, la 1.6, de son logiciel MinKnow ainsi que de son basecaller Albacore (maintenant en 1.1). En outre, ONT a récemment commercialisé des kits de séquençage direct d’ARN et diffusé un pipeline pour réaliser le profil de résistance aux antibiotiques appelé ARMA (an analysis workflow for identification of antibiotic-resistant microorganisms in real time). À partir d’août, la société prévoit d’envoyer des flow cells à la température ambiante, des développements sont en cours pour allonger leur date limite d’exploitation (aujourd’hui une flow cell reçue doit être utilisée sous 8 semaines).  Toujours visant le marché de l’utra-portabilité, en visant la décentralisation de l’acte de séquençage, ONT développe également un petit module de calcul pour le basecalling qui ferait environ la moitié de la taille du séquenceur MinION et pouvant y être directement connecté. Sur ce volet de la portabilité, le dispositif de préparation d’échantillons, VolTrax (voir vidéo ci-dessous), d’Oxford Nanopore est maintenant entre les mains de plus de 50 utilisateurs qui ont récemment reçu leurs premiers kits. La société développe actuellement un kit à base de transposase rapide et un kit d’indexation 4-plex rapide.

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Les chercheurs de l’entreprise travaillent déjà sur une nouvelle version, VolTrax V2, qui devrait être disponible à la fin de 2017. Cette version permettra la PCR, la quantification des échantillons et le contrôle de la qualité des échantillons, tout en utilisant les mêmes aimants et appareils de chauffage que la version actuelle. Il sera également capable de gérer plus d’échantillons et d’exécuter des protocoles de préparation d’échantillons plus complexes. Il sera livré avec un chargeur de réactif avec des réactifs lyophilisés (lyophilisés, c’est mieux, parce que le séquenceur qui tient dans la main c’est bien, mais s’il vous faut un congélateur pour réaliser, sur le terrain, la moindre réaction…)

En mars, Oxford Nanopore a annoncé le lancement du GridIon X5, un séquenceur nanopore de bureau (et non plus de poche comme le MinION) pouvant permettre de travailler jusqu’à 5 flow cells à la fois et disposera d’un débit de 100 Gb par run de 48 heures. La plate-forme est livrée avec un cluster local de calcul haute performance qui permet le basecalling en temps réel ainsi que l’analyse des données. La première unité a été expédiée en début de semaine (en atteste la photo ci-dessous)

La société a récemment utilisé le GridIon pour séquencer un génome humain à 20 X, en utilisant 5 flow cells et la chimie R9.4 (en mode 1D).

Le GridION X5 permet d’exécuter simultanément ou individuellement jusqu’à cinq expériences; Les utilisateurs peuvent choisir d’utiliser tout ou partie de cette ressource à tout moment. La version actuelle de la chimie et du logiciel permet de générer jusqu’à 100 Gb de données pendant une exécution GridION X5 et le module de calcul peut analyser ces données en temps réel.

En utilisant la même technologie de base que le MinION et PromethION, le GridION X5 offre la possibilité de séquencer ADN et ARN en temps réel (dans la vidéo ci-dessous Clive Brown se transforme en Pipetman pour la promotion du GridION) :

GridION pricing

gridion

Oxford Nanopore devait envoyer il y a peu les premiers consommables pour PromethION permettant de délivrer 50 Gb et pourraient en générer jusqu’à 120 Gb /jour dans un futur proche. En vitesse de croisière cette configuration sera capable de générer plus de données que le NovaSeq d’Illumina. Du lourd, du gros et du très petit : de quoi satisfaire les plateformes de séquençages et bientôt certainement des utilisateurs non touchés actuellement par la technologie aujourd’hui, puisque la version ci-dessous permet de préparer une librairie et de la séquencer avec quelques breloques qui tiennent dans le creux d’une main !

La quête du read de 1 Mb : F1000Researchblog

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