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"Oxford Nanopore"
Plusieurs de nos articles évoquent la technologie d’Oxford Nanopore, entre impatience et curiosité.
Le principe de cette technologie : séquencer sans pré-amplification (il s’agit d’un séquenceur de 3ème génération) une molécule d’ADN en en hydrolysant les nucléotides élémentaires, qui passeront dans des pores. Ces pores seront couplés à des capteurs saisissant la signature singulière de chaque base constitutive de la molécule à séquencer. Jusqu’à présent le problème majeur sur lequel ont buté les ingénieurs d’Oxford Nanopore : accélérer la célérité d’acquisition des capteurs ou ralentir le passage des nucléotides au travers des pores -nucléotides qui, au départ, s’engouffraient à plus de 1000 nucléotides par seconde ce qui provoquait des problèmes d’acquisitions des signaux et donc des erreurs, sachant que l’objectif étant de ne pas dépasser les 400 bases / seconde, seuil au-delà duquel le capture devient fou…
Le 3 mai 2012, Oxford Nanopore annonce une collecte de fonds de 31,4 millions de livres (environ 50,8 millions de dollars). Encore plus de fond pour un séquenceur qui deviendrait pour un peu, un gouffre financier… « Ce tour de table a permis une levée de fonds dont la quasi-totalité provient d’investisseurs existants, ces fonds permettront un développement de l’entreprise, comprenant le développement de notre infrastructure, un renforcement de nos forces de vente, une optimisation de la fabrication et la poursuite de la R & D » a déclaré le Dr Gordon Sanghera, chef de la direction d’Oxford Nanopore. Oxford Nanopore se préparerait donc (enfin) à vendre ses produits qui sont attendus pour la fin d’année 2012. Phénomène plutôt rassurant pour la société anglaise, elle bénéficie de la confiance renouvelée de ces investisseurs, plus informés que nous sur ce que renferment (vraiment) ses tiroirs.
Eviter l’écueil d’un PacBio, trop cher, commettant trop d’erreurs, arrivé pour occuper le marché balbutiant du séquençage troisième génération, semble être la marque d’Oxford Nanopore -une société qui prend son temps. Après la possibilité de séquencer des molécules d’ADN à l’état natif, de taille très longue, en un temps record, il semble qu’Oxford Nanopore, avec ce nouvel appel de fonds, ficelle sa stratégie commerciale pour un lancement en grande pompe de leurs 2 références : le GridION & le MinION, la clé USB qui séquence dont vous pouvez voir la photographie ci-contre
Noblegen Biosciences, start-up localisée dans le Massachusetts, ambitionne de commercialiser pour 2014 « optipore » (pour « optical detection » et « nanopore ») , un séquenceur de paillasse de troisième génération combinant nanotechnologies et un système de lecture optique permettant de réduire drastiquement les coûts de séquençage. L’objectif est de conquérir le marché des laboratoires cliniques dans la perspective de l’émergence d’une médecine personnalisée et de proposer ainsi un séquençage de génome humain complet à faible coût et dans un temps record. Dans cette course engagée, la société américaine se trouve en bonne position.
A l’instar du PGM Ion torrent, une puce en silicium constitue le coeur de la machine et renferme des centaines de nanopores. 
La molécule d’ADN unique native destinée à être séquencée est tout d’abord convertie en une nouvelle molécule synthétique transformant chaque base par une séquence nucléotidique spécifique correspondante. A chacune des quatre signatures nucléotidiques correspond un « molecular beacon » complémentaire fluorescent initialement inactivé par un système de « quencher ». Leurs hybridations au brin néoformé aboutit à un ADN double brin. la molécule est dirigé vers les nanopores par des échanges ioniques et en raison de la taille des orifices, les « molecular beacon » sont contraints à se deshybrider libérant cette fois une fluorescence, lue par un capteur photographique de type CMOS, qui est traduite en séquence.
L’ensemble des études et preuves de faisabilité sur lesquelles repose la technologie de séquençage « optipore » sont décrites et détaillées au travers de l’article libre d’accès ci dessous:
A ce jour, peu de caractéristiques techniques liées à cette plateforme filtrent mais Frank Feist, cofondateur de la société, annonce une capacité de séquençage de 500 Gb/heure. De plus, en raison de l’étape de conversion initiale, la taille des fragments serait limitée à 200 bases.
Un soutien de 4,2 millions de dollars en septembre dernier de la part du National Human Genome Research Institute devrait permettre à la société américaine de conforter cette avancée prometteuse.
L’AGBT qui a eu lieu du 15 au 18 février, à Marco Island, a fait la part belle à la technologie d’Oxford Nanopore, ainsi qu’il avait été prévu. La société dont il est question a profité du rassemblement pour lever le voile sur 2 produits : le MinION et le GridION, il est à noter que le MinION, mini-système de séquençage de la taille d’une grosse clé USB (photo ci-contre) a une dénomination commerciale tout particulièrement adaptée au marché français.
La technologie d‘Oxford Nanopore a été évoquée dans plusieurs de nos articles. Elle permet le séquençage et l’analyse à haut-débit de reads de taille ultra longue (plusieurs kb) en temps réel pour pas très cher : la promesse d’un séquençage de 3ème génération démocratisé. Clive G. Brown (directeur de la technologie chez Oxford Nanopore) a présenté ses deux nouveaux jouets :
– Le MinION (dont le prix serait inférieur à 900 $) est un consommable et séquenceur (les deux à la fois) jetable qui devrait permettre de générer 1 Gb de données
– Le GridION (que vous pouvez empiler à foison, voire photo ci-dessous) permet quant à lui de générer, par module, plusieurs dizaines de Gb / jour (on pencherait pour un minimum de 25 Gb) sachant que selon nos informations un module aurait un coût voisin de 30 k$. Oxford Nanopore insiste sur le fait qu’à la Gb générée ils seront concurrentiels en terme de coût des consommables. En outre, le volume de données générées s’adapte à la problématique de l’utilisateur puisqu’en effet tant que l’appareil séquence -d’où leur slogan « Run Until« – il génère des données (le débit journalier associé à une technologie prend tout son sens ici). La cartouche –consommable de séquençage– associée à la technologie GridION possède actuellement 2000 pores individuelles -en 2013, il est prévu de passer à un consommable en comportant 8000- avec cette évolution il sera donc possible avec 20 modules GridION (environ l’investissement équivalent à un HiSeq2000) de séquencer un génome humain en 15 minutes ! Une autre façon de voir les chose est la suivante, dans sa version « actuelle » à 2000 pores disponibles : pour un prix équivalent à celui d’une configuration de type Ion Proton, 5 modules GridION seront capables de séquencer un génome humain à 30 X (cela leur prendrait une demie journée).
D’autres éléments ont filtré lors de l’AGBT. En effet, il semblerait que la technologie d’Oxford Nanopore subisse un taux d’erreurs sur séquences brutes encore assez élevé de 4 % (comparé aux plus de 10 % pour la technologie de Pacific Bioscience). Clive G. Brown aurait laissé entendre que ce taux d’erreurs serait uniforme et le fruit d’une majorité d’erreurs systématiques (ce qui est plutôt bon signe, en vue d’une rapide amélioration du système). Au niveau du système de détection, une puce GridION comporte 2K capteurs (un par pore). Chaque capteur permet de distinguer 64 signaux différents, ceci a permis d’analyser le passage de triplets de base afin de pouvoir discriminer 4x4x4 profils différents (j’avoue que j’attendais plus : quid de la prise en compte d’un signal différentiel en cas de présence d’une 5-méthylcytosine ?).
Au niveau préparation des échantillons, un séquenceur de 3ème génération ne nécessite pas de phase d’amplification. Hormis une phase préalable de légère fragmentation de l’échantillon rien ne semble envisagé. Pour palier leur problème de fiabilité, on imagine aisément qu’à l’instar de Pacific Bioscience, une circularisation de l’ADN de l’échantillon permettra d’engendrer en séquençage un nombre suffisant de répétitions venant atténuer ce point négatif.
Un élément important -mais pas surprenant- réside dans la politique commerciale affichée : une distribution directe des machines ainsi qu’une adaptation tarifaire (en usant de forfaits) offrant la possibilité d’acheter la machine à prix réduit avec un report sur le coût des consommables devrait permettre à Oxford Nanopore de conquérir quelques marchés n’en doutons pas !
Le représentant européen des séquenceurs haut-débit de troisième génération, Oxford Nanopore va communiquer à l’AGBT… dans quelques jours. La société en profitera pour annoncer la commercialisation de ses premières machines permettant de séquencer en 24 heures un génome humain pour moins de 1000 $ (soit le même prix qu’un génome humain séquencé par un Ion Proton en 2 heures sur une plateforme de deuxième génération).
Oxford Nanopore souhaite commercialiser sa machine (en direct) avant la fin 2012. Un réelle course a lieu, puisqu’à cette échéance sera commercialisé le Ion Proton. Nous assisterons donc avant fin 2012 a un chevauchement technologique où 2ème et 3ème générations de séquenceurs risquent de se télescoper… les scientifiques en cours d’élaboration de dossiers de demandes de financements devront (vite) choisir leur camp… : partir sur une technologie qui a d’ores-et-déjà fait ses preuves (Ion Proton) donc de 2ème génération ou une technologie de 3ème génération totalement innovante… mais dont on ne possède pas de retour indépendant sur la qualité des données générées. La « guerre » technologique est lancée entre le transfuge de Solexa (technologie des séquenceurs Illumina), John Milton, le responsable scientifique d’Oxford Nanopore et la biotech’ rock-star Jonathan Rothberg, responsable scientifique de Ion Torrent chez Life Technologies.
Depuis la publication de 2006, d’Astier and al., J. Am. Chem. Soc., la communauté scientifique attendait la révolution du séquençage 3ème génération que constituait la géniale idée d’Oxford Nanopore : à savoir l’alliance des nanotechnologies, du génie génétique le tout à des fins de séquençage (et plus si affinité). Ainsi, un pore d’alpha-hémolysine (d’environ 1 nanomètre) ou la porine A de Mycobacterium smegmatis ou bien encore du graphène ont été investigués pour devenir le pore idéal dans lequel, après clivage par une exonucléase des liaisons phosphodiester, les bases azotées dont l’enchaînement constitue le séquençage passe afin d’être analysées (par analysées on entend lues, la lecture étant basée sur la différence de conductance électrique liée à la nature chimique des bases azotées). Le pari, pour Oxford Nanopore réside dans le fait de trouver un mode de détection suffisamment sensible pour analyser puis par puis un signal généré par le passage d’une base au travers de pores (autrement appelés trous). La résolution de la technologie constituait un défit, sa faiblesse provenait (espérons que ce verbe se conjugue aujourd’hui au passé) de la rapidité de passage des bases à travers le pore (1 à 5 µs / base)…
Une attente à émouvoir un James Dewey Watson, plusieurs publications en guise de démonstration de la faisabilité d’un tel séquençage, des appels de fonds ayant abouti à l’intégration d’Illumina au niveau du capital d’Oxford Nanopore (investissement en deux fois d’abord de 28 millions $ puis de 41 millions) ont maintenu en haleine les scientifiques avides de séquençage 3ème génération.
Oxford Nanopore est l’un des seuls acteurs européens, dans le monde du séquençage haut-débit où l’hégémonie californienne est écrasante… Alors que les Californiens (PacBio, Life, Illumina) communiquent à grand renfort d’annonces choc, Oxford Nanopore garde une part de mystère (aucune spécification réellement disponible à ce jour), nourrissant notre curiosité avec quelques publications scientifiques et quelques animations dont certaines vous sont présentées ci-dessous.
http://vimeo.com/18630569
Cette première animation reprend les différentes modalités de séquençage
http://vimeo.com/20289048
Avec la vidéo ci-dessus et celle ci-après, Oxford Nanopore réinvente le magnétoscope VHS à visée séquençage haut-débit…
http://vimeo.com/19288315
Finalement, le message à peine subliminal de ce court article : Oxford Nanopore est une société à surveiller de près… de plus en plus près.
Note : si les liens vers les vidéos ne fonctionnent pas essayer toujours en suivant celui-ci…
En effet, la promesse de décentralisation du séquençage portée par le MinION est séduisante (un séquenceur légèrement plus grand qu’une clé usb a permis de séquencer Ebola en Guinée). Evidemment, à grand renfort de communication dont nous nous faisons d’ailleurs souvent écho, Oxford Nanopore Technologies (ONT) entretient le désir pour créer une attente motivant les levées de fonds, ces mêmes fonds qui permettront de développer les forces de ventes nécessaires au déploiement de la technologie. ONT affiche d’ores et déjà une centaine de publications scientifiques. Pour répondre à l’épineuse question « est ce que ONT est une technologie de rupture (disruptive innovation)? », on fait appel au modèle de Clayton Christensen.
Christensen a développé sa théorie en s’intéressant à plusieurs industries et notamment au secteur de la santé. Selon lui, l’innovation de rupture est un agent de transformation d’une industrie, et elle repose sur trois leviers :
- Un développement de la technologie et du savoir en général du domaine qui deviennent de plus en plus accessibles
- De nouveaux modèles économiques
- Un nouveau réseau de valeur
Ainsi que tente de le montrer le graphe ci-dessus, au départ, une innovation en rupture est moins performante que ce qui peut exister sur le marché. Ceci est vrai jusqu’à ce qu’elle progresse pour, au final, redéfinir le marché (l’exemple de l’appareil photo numérique est pas si mauvais puisque l’on comprend qu’il fait sonner le glas de la pellicule argentique aujourd’hui devenu un marché de niche).
Selon beaucoup d’observateurs, le marché du séquençage va être profondément changé par l’amélioration de la technologie que propose ONT. Ainsi tel que le prévoit le modèle de Christensen, ONT va toucher des « consommateurs » qui n’ont aujourd’hui même pas connaissance du principe même du séquençage haut-débit. Pensons qu’aujourd’hui des botanistes échantillonnent à l’aide du MinION, des espèces végétales en Amazonie pour les séquencer afin de formellement identifier de nouvelles espèces.
Donc au départ une technologie disruptive possède des performances dégradées par rapport à la concurrence… puis les améliorations successives permettent d’amorcer un franchissement exponentiel des lignes (rouges sur le schéma ci-dessus). Ces lignes sont liées aux applications, elles-mêmes fonction des performances attendues par les divers segments de marché.
Le 17 Octobre 2016 avec l’arrivée de la chimie 9.4 qui délivre ~ 10 Gb de débit avec une précision de 92% sur lecture 1D, et une précision de 99% + chez (certains) clients sur les lectures 2D (97% Sur leur site Web), il semble qu’ONT ait amorcé son exponentielle ascension. Ces améliorations remarquables de performance (accroissement du débit par un facteur de 40 au cours des 2 dernières années) ont permis à la technologie d’atteindre un point d’inflexion et peuvent maintenant satisfaire les attentes liées aux applications « bas de gamme » (les maladies infectieuses, l’analyse de microbiome, l’assemblage de novo, l’assemblage de petit génomes, et même les applications cliniques à moyen terme). Au 30 septembre 2016, la société dénombrait environ 3 000 unités sur le terrain pour plus de 2 200 clients. Sur la base des développements au cours des 2 derniers mois, nous prévoyons que ce nombre augmentera rapidement en 2017, car la société et la technologie (PromethION – environ une douzaine ont été expédiés à ce jour) continueront sur leur lancée.
Après de longues péripéties où il s’agissait de ralentir la progression d’une molécule d’ADN à travers un nanopore, après quelques investissements (de la part d’Illumina, essentiellement) il semblerait que la société, Oxford Nanopore s’apprête à vendre les deux produits dont elle fait la promotion depuis plusieurs mois. Ces deux produits n’existaient alors que dans les couloirs de l’AGBT (en 2012, parce que cette année il semble qu’Oxford Nanopore fasse profil bas à l’AGBT2013… à moins que…) et sur le site internet de la société encore un peu britannique.
Quelques médias d’outre-Manche évoquent cette fameuse technologie de séquençage en l’affublant du qualificatif de « future grande invention britannique » : lire à ce sujet la page web de « The Raconter » : Britain greatest inventions ». Cette invention est associée à la seule médecine personnalisée comme pour envisager le futur marché du séquençage haut-débit.
Les voyants semblent donc au vert pour Oxford Nanopore. Pour préparer le terrain, sort en ce début d’année, un article de Nature Methods : « disruptive nanopores« . Un titre qui fait écho à celui de Forbes (février 2012) repris dans notre image ci-dessus.
Nicole Rusk, rédactrice en chef à Nature Methods, vient avancer les principales caractéristiques du futur produit :
– des reads entre 10 et 100 kb
– des taux d’erreurs entre 1 et 4 %
– la possibilité de connaître les bases méthylées
– la possibilité de séquencer directement l’ARN
– la méthode est non destructive
La technologie de séquençage de 3ème génération par nanopores promet de révolutionner plusieurs applications à commencer par le séquençage de novo en laissant peu d’espoir à la technologie de Pacific Biosciences. Elle devrait remplacer PacBio dans les stratégies de séquençage hybride (qui consiste « à coupler » un séquenceur de 2ème génération permettant d’être très profond et d’une technologie de 3ème génération permettant de générer des reads très longs ce qui permet au final un assemblage de meilleure qualité).
Après avoir engendré de la curiosité, de l’impatience, puis déçu avec une arrivée sans cesse repoussée, il semble qu’Oxford Nanopore doive prouver de l’efficacité de sa technologie. Ainsi, la société britannique a annoncé le 8 janvier 2013, une série d’accords avec plusieurs institutions telles que l’ Université de l’Illinois, l’Université Brown, l’Université de Stanford , l’Université de Boston, de Cambridge et de Southampton. Oxford Nanopore prend son temps ou rencontre des difficultés avec son exonucléase. Malgré ses dizaines de brevets, pour conserver sa crédibilité la société a dû communiquer pour convaincre de l’efficience de sa technologie en minimisant les difficultés de développements, en alimentant les tuyaux de communication avec des séquenceurs sorti de palettes graphiques loin d’être finalisés.
Ce retard de lancement s’apparente t’il à un gage de sérieux ou est-il la preuve que le séquençage par nanopores rencontre de grosses, très grosses difficultés de développement ? Réponse en 2013.
Le London Calling a été l’occasion pour Oxford Nanopore Technologies (ONT) de frimer un peu avec des annonces et une gamme de séquenceurs ciblant des marchés très différents. Cette technologie de rupture risque d’être un tsunami technologique pour finir par déferler dans nos vies, car avec un séquenceur qui tient dans la poche et se connecte à un smartphone, ce qui était hier science fiction devient réalité.
ONT a fourni, en ce début de mois de mai 2017, informations concernant les développements technologiques et les perspectives de commercialisation. L’une d’elles, concerne une nouvelle « flow cell » pour MinIon, appelée Flongle (Flow Cell Dongle) pour les applications de diagnostics cliniques. Le développement du Flongle aidera également le travail de l’entreprise sur SmidgION, un séquenceur miniature avec de petites flow cells alimentées par un téléphone mobile (voir la photo ci-dessous).
Clive Brown, responsable technologique d’ONT, a donc présenté diverses mises à jour lors du « London Calling 2017 », le grand barnum des utilisateurs de la technologie, en ce début de mois de mai. En ce qui concerne le séquenceur MinION, Brown a déclaré que la technologie est d’ores et déjà capable de délivrer plus de 20 Gb de données par run de 48 h. (Actuellement, les utilisateurs sont plus autour des 15 Gb, ce rendement plus limité serait partiellement lié à la préparation de la bibliothèque, en particulier la quantification appropriée de la taille et de la quantité d’ADN de départ, selon Brown).
En mars, la société avait parlé d’une nouvelle méthode de séquençage, appelée séquençage 1D2, où les deux brins d’une librairie bicaténaire sont poussés par nanopore séquentiellement sans être physiquement connectés. La méthode contourne un brevet détenu par Pacific Biosciences et aboutit à des lectures plus précises que la seule lecture 1D, où seul un brin de la librairie constituée est séquencé. ONT prévoit de publier le kit de séquençage 1D2 courant mois de mai 2017, ainsi qu’une nouvelle chimie appelée R9.5. Les kits 2D ne sont plus disponibles et l’entreprise vient juste d’interrompre les anciennes cellules R9.4.
Dans l’ensemble, la précision de lecture brute est maintenant supérieure à 90 % pour la chimie R9.4 et supérieure à 95 % pour la R9.5 (en mode 1D2), ces deux chimies tournant à 450 bases / min.
Ci-dessus, les prix actuels de la chimie 9.5. Là où l’on constate que le prix décroit drastiquement avec la quantité commandée… je pense qu’une mutualisation ou la création d’une centrale d’achats s’imposent ! Avec cette nouvelle chimie,ONT a diffusé une nouvelle version, la 1.6, de son logiciel MinKnow ainsi que de son basecaller Albacore (maintenant en 1.1). En outre, ONT a récemment commercialisé des kits de séquençage direct d’ARN et diffusé un pipeline pour réaliser le profil de résistance aux antibiotiques appelé ARMA (an analysis workflow for identification of antibiotic-resistant microorganisms in real time). À partir d’août, la société prévoit d’envoyer des flow cells à la température ambiante, des développements sont en cours pour allonger leur date limite d’exploitation (aujourd’hui une flow cell reçue doit être utilisée sous 8 semaines). Toujours visant le marché de l’utra-portabilité, en visant la décentralisation de l’acte de séquençage, ONT développe également un petit module de calcul pour le basecalling qui ferait environ la moitié de la taille du séquenceur MinION et pouvant y être directement connecté. Sur ce volet de la portabilité, le dispositif de préparation d’échantillons, VolTrax (voir vidéo ci-dessous), d’Oxford Nanopore est maintenant entre les mains de plus de 50 utilisateurs qui ont récemment reçu leurs premiers kits. La société développe actuellement un kit à base de transposase rapide et un kit d’indexation 4-plex rapide.
Les chercheurs de l’entreprise travaillent déjà sur une nouvelle version, VolTrax V2, qui devrait être disponible à la fin de 2017. Cette version permettra la PCR, la quantification des échantillons et le contrôle de la qualité des échantillons, tout en utilisant les mêmes aimants et appareils de chauffage que la version actuelle. Il sera également capable de gérer plus d’échantillons et d’exécuter des protocoles de préparation d’échantillons plus complexes. Il sera livré avec un chargeur de réactif avec des réactifs lyophilisés (lyophilisés, c’est mieux, parce que le séquenceur qui tient dans la main c’est bien, mais s’il vous faut un congélateur pour réaliser, sur le terrain, la moindre réaction…)
En mars, Oxford Nanopore a annoncé le lancement du GridIon X5, un séquenceur nanopore de bureau (et non plus de poche comme le MinION) pouvant permettre de travailler jusqu’à 5 flow cells à la fois et disposera d’un débit de 100 Gb par run de 48 heures. La plate-forme est livrée avec un cluster local de calcul haute performance qui permet le basecalling en temps réel ainsi que l’analyse des données. La première unité a été expédiée en début de semaine (en atteste la photo ci-dessous)
La société a récemment utilisé le GridIon pour séquencer un génome humain à 20 X, en utilisant 5 flow cells et la chimie R9.4 (en mode 1D).
Le GridION X5 permet d’exécuter simultanément ou individuellement jusqu’à cinq expériences; Les utilisateurs peuvent choisir d’utiliser tout ou partie de cette ressource à tout moment. La version actuelle de la chimie et du logiciel permet de générer jusqu’à 100 Gb de données pendant une exécution GridION X5 et le module de calcul peut analyser ces données en temps réel.
En utilisant la même technologie de base que le MinION et PromethION, le GridION X5 offre la possibilité de séquencer ADN et ARN en temps réel (dans la vidéo ci-dessous Clive Brown se transforme en Pipetman pour la promotion du GridION) :
Oxford Nanopore devait envoyer il y a peu les premiers consommables pour PromethION permettant de délivrer 50 Gb et pourraient en générer jusqu’à 120 Gb /jour dans un futur proche. En vitesse de croisière cette configuration sera capable de générer plus de données que le NovaSeq d’Illumina. Du lourd, du gros et du très petit : de quoi satisfaire les plateformes de séquençages et bientôt certainement des utilisateurs non touchés actuellement par la technologie aujourd’hui, puisque la version ci-dessous permet de préparer une librairie et de la séquencer avec quelques breloques qui tiennent dans le creux d’une main !
La quête du read de 1 Mb : 
Il y a peu, le système MiSeqDx a été la première plate-forme de séquençage haut-débit approuvée par la FDA (US Food and Drug Administration) pour le diagnostic in vitro (IVD). Ceci élargit encore les applications de ces couteaux suisses de la génomique pour aller flirter avec les promesses d’une médecine de précision. C’était, en partie, le souhait des promoteurs des séquenceurs de paillasse (benchtop sequencer) du MiSeq en passant par le Ion Torrent pour aller jusqu’au prometteur séquenceur-clé USB, d’Oxford Nanopore. Ce dernier permet une analyse en temps réel des données générées par le séquenceur. Ce mode opératoire, le temps réel, trouve tout son sens dans le cadre d’applications cliniques où le temps est l’ennemi du clinicien.
Alors que les mappeurs permettant de confronter des reads générés à une référence génomique, sont optimisés pour être de plus en plus rapides, il est très étonnant voire absurde de constater que cette étape ne pouvait être réalisée qu’une fois le run de séquençage, terminé. Aujourd’hui, cet affront fait au bon entendement est en passe d’être réparé dans cette publication, d’octobre 2016, dans Bioinformatics où l’équipe de bioinformatique du Robert Koch Institute propose une première approche dans le sens d’une analyse en temps réel (à base d’extension de k-mers). Une affaire à suivre et un code source disponible : https://gitlab.com/SimonHTausch/HiLive
Source de l’article : HiLive – Real-Time Mapping of Illumina Reads while Sequencing, Bioinformatics. 2016 Oct 29
Le séquençage haut-débit voit cohabiter depuis quelques années deux générations de séquenceurs.
Au passage, une question Trivial Pursuit pour laquelle il faudra avoir un œil de caracal : quelqu’un sait quelle société a développé la première génération de séquenceurs haut-débit ? et quand ?
Les séquenceurs de deuxième génération se voient conditionnés sous forme de séquenceurs de paillasse (PGM de Ion Torrent, Miseq d’Illumina, GS-junior de Roche) permettant une démocratisation du séquençage, pendant que leurs grands frères pulvérisent la loi de Moore pour envisager un rendement (coût / Mb) toujours plus compétitif.
La large diffusion du séquençage de 3ème génération se laisse désirer laissant le champ libre à la génération précédente. Cet article vise à réaliser un court état des lieux du séquençage haut-débit de troisième génération : un futur plus ou moins lointain, de nouvelles applications potentielles.
La question : séquenceurs de 3ème génération, l’âge de raison, c’est pour quand ? est l’interrogation qui a hanté l’AGBT 2013 marqué par le silence d’Oxford Nanopore. Cette année 2013 fut marquée par le retrait d’Illumina du capital de la société britannique : « Oxford Nanopore Technologies Ltd a annoncé la vente d’une participation détenue par son concurrent américain Illumina Inc., une étape vers la fin d’une relation pleine de conflits dans la course au développement des séquenceurs haut-débit permettant de séquencer plus rapidement et pour moins cher. »
Avant de caractériser ce que sont, seront, pourront être les 3ème générations de séquenceurs, commençons par un rapide tour des caractéristiques générales de leurs prédécesseurs et principalement de ce qui constitue leurs points faibles :
– la phase d’amplification clonale (réalisée par PCR) est source de biais (doublons, erreurs de PCR)
– les problèmes liés au déphasage engendrant une chute de la qualité le long du read produit (ce qui bride la production de reads vraiment longs)
-des reads courts (de moins d’une centaine à environ 800 bases – vous l’aurez noté ce point est en partie une conséquence du précédent)
-des machines et des consommables onéreux
– des temps de run longs
Ainsi l’objectif principal des séquenceurs de 3ème génération est de palier les défauts de leurs aînés en produisant des reads plus longs, plus vite pour moins cher. Les séquenceurs de 2ème génération, quels que soient leurs modes de détection (mesure de fluorescence, mesure de pH) sont trop peu sensibles pour envisager la détection d’une simple molécule, d’un simple nucléotide : nécessairement la librairie doit être amplifiée, ce qui provoque des biais, des temps de préparation relativement longs et l’usage de consommables qui impacte le coût final de séquençage… assez rapidement la qualité chute plus vos reads s’allongent ce qui oblige à brider les tailles de reads que ces technologies sont capables de délivrer. En outre, travaillant sur une matrice qui est une copie de votre librairie initiale, l’information portée par les bases méthylées est perdue (ceci oblige à ajouter une phase de traitement au bisulfite qui peut être hasardeuse)
Actuellement l’une des seules technologies de 3ème génération réellement utilisée est celle de Pacific Biosciences (les hipsters disent « PacBio »). La firme, fondée en 2004, a lancé en 2010, son premier séquenceur de troisième génération le Pacbio RS basé sur une technique de séquençage SMRT (Single Molecule Real Time sequencing.) Aujourd’hui la société Roche qui n’a pu absorber Illumina lors de son OPA, a investi 75 millions de USD, le 25 septembre 2013, pour co-développer des kits diagnostiques in vitro exploitant la technologie de PacBio.
La technologie de PacBio est aujourd’hui exploitée pour réaliser du séquençage de novo de petits génomes :
Avec ces 200 à 300 Mb délivrés par SMRT-cell, séquencer des organismes eucaryotes supérieurs demande un investissement important, malgré tout, cette technologie délivrant des reads de plusieurs milliers de bases, permet d’envisager une diminution du nombre de contigs obtenus par les seules stratégies reads-courts / gros débit.
Face à la technologie proposée par PacBio, d’autres technologies essaient d’émerger pour arriver à occuper le marché du séquençage de 3ème génération :
– La combinaison détection optique et multipore est une voie envisagée pour le séquençage de 3ème génération avec le travail mené par NobleGen biosciences.
– L’imagerie directe de l’ADN
Le microscope électronique offre une résolution possible jusqu’à 100 pm, de sorte que les biomolécules et les structures microscopiques tels que des virus, des ribosomes, des protéines, des lipides, des petites molécules et des atomes même simples peuvent être observés. Bien que l’ADN est visible lorsqu’on l’observe avec un microscope électronique, la résolution de l’image obtenue n’est pas suffisamment élevée pour permettre le déchiffrement de la séquence, c’est à dire, le séquençage de l’ADN. Cependant, lors du marquage différentiel des bases de l’ADN avec des atomes lourds ou des métaux, un tel séquençage devient possible.
– Le séquençage à l’aide de transistor (Transistor-mediated DNA sequencing– une technologie développée par IBM)
Dans le système conceptualisé par IBM, l’ADN est contraint de passer par le pore à cause de la tension électrique subie, la vitesse de passage de la molécule à séquencer est maîtrisée à l’aide de contacts métalliques à l’intérieur du nanopore. La lecture des bases serait réalisée lors du passage de l’ADN simple brin au travers du pore (ça rappelle quelque chose…)
– Et Oxford Nanopore dans tout cela ? Si la société anglaise a annoncé la vente de la participation d’Illumina, elle a marqué l’année 2013 par son silence assourdissant. Passé l’oxymore, en cette fin d’année, coup de poker ou réel lancement, Oxford Nanopore propose un programme d’accès à sa technologie Minion où pour 1000 USD, il est possible de postuler à l’achat des clés USB de séquençage.
La stratégie d’Oxford Nanopore est basée, en partie, sur la possible démocratisation du séquençage de 3ème génération, elle s’oppose à celle de PacBio qui mise sur son arrivée précoce sur le secteur du séquençage haut-débit : décentralisation contre l’inverse. En clair, l’investissement d’un PacBio est tel que l’outil est réservé à des centres, des prestataires de services pouvant assumer cet investissement, ce qui oblige à centraliser les échantillons pour les séquencer, contre les produits (encore en développement) d’Oxford Nanopore dont la promesse est : le séquençage pour tous (ou presque).
PacBio revendique sa participation à un projet qui consiste à doubler la quantité de génomes bactériens « terminés » (actuellement de 2384) en quelques mois.
En cliquant ci-dessus sur la représentation graphique qui illustre la différence de plasticité de génome entre le génome d’une Bordetella pertussis (l’agent pathogène responsable de la coqueluche) et celui d’Escherichia coli, un poster vous apparaîtra. Ce dernier reprend les caractéristiques de l’utilisation de la technologie de PacBio à des fins d’assemblage de novo de génomes bactériens par une stratégie non-hybride (seuls des reads de PacBio sont utilisés). Les résultats sont assez bluffants, la longueur des reads de PacBio permet un assemblage complet (au prix de plusieurs SMRT cells tout de même !), de génomes bactériens « difficiles » tel que celui de Bordetella pertussis connu pour posséder un GC % relativement élevé (environ 65 %) ainsi que de nombreux éléments transposables. Les génomes possédant de nombreux éléments répétés posent de grandes difficultés d’assemblage, c’est un des arguments qui permet à PacBio de positionner sa technologie actuellement… en quelques mois les stratégies hybrides (reads courts générés par des séquenceurs de 2ème génération) ont laissé place aux stratégies non-hybrides où le séquençage PacBio se suffit à lui-même.
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